Методы диагностики гельминтозов. Методы определения жизнеспособности яиц и личинок гельминтов
Чаще всего заражение гельминтами происходит через зараженную пищу, воду, а также через немытые руки.
Прямые и косвенные методы диагностики гельминтозов
На сегодняшний день разработано множество методов диагностики гельминтозов, однако всех их можно разделить на две большие группы: прямые и косвенные. К прямым методам диагностики относятся те исследования, которые позволяют непосредственно выявить гельминты, их фрагменты, личинки или яйца. Косвенные методы диагностики гельминтозов основываются на выявлении вторичных изменений, характерных для той или иной разновидности гельминтоза.
Самыми популярными прямыми методами диагностики гельминтозов являются макро- и микрогельминтоскопические методы исследований.
Макрогельминтоскопические методы исследования
Вопросы читателей
18 October 2013, 17:25 Добрый день. Уже около почти год ощущаю зуд вокруг анального отверстия. Никаких болевых ощущений. Подскажите к кому обратится и что это может быть? Спасибо
Задать вопросМикрогельминтоскопические методы исследования
Иммунологические методы исследования
Диагностики гельминтозов основаны на обнаружении в сыворотке крови специфических антител к тем или иным гельминтам. Для иммунологического исследования применяется метод непрямой гемагглютинации, иммуноферментного анализа, иммуноэлектрофореза, иммуноабсорбции и другие серологические методы исследований крови.
Иммунологические методы исследования применяются для диагностики альвеококкоза, эхинококкоза, цистицеркоза, аскаридоза, шистосомоза и других гельминтозов.
Анализ желчи и дуоденального содержимого
Биопсия
Электропунктурная диагностика
Электропунктурная диагностика основана на анализе сопротивления кожи при раздражении ее слабым электрическим током. Электропунктурная диагностика при подозрении на гельминтоз может проводиться двумя способами: по методу Фолля или с помощью резонансного тестирования.
Инструментальные методы исследования
При гельминтозах также проводится ультразвуковое исследование, ФЭДГС, и компьютерная диагностика. Эти методы позволяют определить степень вреда, нанесенного гельминтами, а также определить состояние отдельных органов.
7.7. Методы определения жизнеспособности яиц и личинок гельминтов
Жизнеспособность яиц гельминтов определяют по внешнему виду, путем окрашивания витальными красками, культивированием в оптимальных условиях и постановкой биологической пробы.
7.7.1. Определение жизнеспособности яиц или личинок гельминтов по внешнему видуЯйца гельминтов микроскопируют вначале при малом, затем при большом увеличении. У деформированных и мертвых яиц гельминтов оболочка разорвана или прогнута внутрь, плазма мутная, разрыхлена. У сегментированных яиц шары дробления (бластомеры) неравного размера, неправильной формы, часто сдвинуты к одному полюсу. Иногда встречаются аномальные яйца, которые, имея внешние уродства, развиваются нормально. У живых личинок аскарид мелкая зернистость имеется только в средней части тела, по мере их гибели она распространяется по всему телу, появляются крупные блестящие гиалиновые вакуоли, так называемые "нитки жемчуга".
Для определения жизнеспособности зрелых яиц аскарид, власоглавов, остриц следует вызывать активные движения личинок легким подогреванием препарата (до температуры не выше 37 °С). Жизнеспособность личинок аскарид и власоглавов удобнее наблюдать после их выделения из скорлупы яйца надавливанием на покровное стекло препарата препаровальной иглой или пинцетом.
У инвазионных личинок аскарид часто замечается чехлик, отслоившийся на головном конце, а у закончивших развитие в яйце личинок власоглавов на этом месте при большом увеличении обнаруживается стилет. У погибших личинок гельминтов независимо от их места нахождения (в яйце или вне его) замечают распад тела. При этом внутренняя структура личинки становится глыбчатой или зернистой, а тело мутным и непрозрачным. В теле обнаруживаются вакуоли, а на кутикуле - разрывы.
Жизнеспособность онкосфер тениид (бычьего, свиного цепней и др.) определяют по движению зародышей при воздействии на них пищеварительных ферментов. Яйца помещают на часовое стекло с желудочным соком собаки или искусственным дуоденальным соком. Состав последнего: панкреатина - 0,5 г, натрия бикарбоната - 0,09 г, дистиллированной воды - 5 мл. Часовые стекла с яйцами ставят в термостат при 36 - 38 °С на 4 часа. При этом живые зародыши освобождаются от оболочек. Оболочки живых онкосфер также растворяются в подкисленном пепсине и в щелочном растворе трипсина через 6 - 8 часов в термостате при 38 °С.
Если поместить яйца тениид в 1%-ный раствор натрия сульфида или 20%-ный раствор натрия гипохлорида, или же в 1%-ный раствор хлорной воды при 36 - 38 °С, зрелые и живые зародыши освобождаются от оболочек и не изменяются в течение 1 суток. Незрелые и мертвые онкосферы сморщиваются или набухают и резко увеличиваются, а затем "растворяются" в течение 10 минут - 2 часов. Живые зародыши тениид также активно двигаются в смеси 1%-ного раствора натрия хлорида, 0,5%-ного раствора натрия гидрокарбоната и желчи при 36 - 38 °С.
Жизнеспособность адолескариев фасциол, собранных на растениях и других объектах водоемов, проверяют исследованием их на предметном стекле в физиологическом растворе под микроскопом с нагревательным столиком. При подогревании личинки трематоды, находящиеся в цисте, начинают двигаться.
Для определения жизнеспособности яиц карликового цепня наиболее проста методика Иониной Н.С.: у живых яиц медианная пара эмбриональных крючьев или параллельна латеральным, или последние образуют с медианной угол у основания меньше 45°. У мертвых яиц латеральные пары образуют у основания угол с медианной парой больше 45° или же крючья беспорядочно разбросаны (утрачивается их парное расположение); иногда наблюдается сморщивание зародыша, образование зернистости. Более точен метод, основанный на появлении движений онкосферы при резкой смене температур: от 5 - 10° до 38 - 40 °С.
Определение жизнеспособности незрелых яиц нематод следует изучать во влажной камере (чашках Петри), помещая яйца аскарид в 3%-ный раствор формалина, приготовленный на изотоническом растворе натрия хлорида при температуре 24 - 30 °С, яйца власоглавов в 3%-ном растворе соляной кислоты при температуре 30 - 35 °С; яйца остриц в изотоническом растворе натрия хлорида при температуре 37 °С. Чашки Петри следует открывать 1 - 2 раза в неделю для лучшей аэрации и снова увлажнять фильтровальную бумагу чистой водой.
Наблюдения за развитием яиц гельминтов ведут не реже 2 раз в неделю. Отсутствие признаков развития в течение 2 - 3 месяцев свидетельствует о их нежизнеспособности. Признаками развития яиц гельминтов являются сначала стадии дробления, деление содержимого яйца на отдельные бластомеры. В течение первых дней развивается до 16 бластомер, которые переходят во вторую стадию - морулу и т.д.
Яйца анкилостомид культивируют в стеклянном цилиндре (высотой 50 см и диаметром 7 см), закрытом пробкой. Смесь из равных объемов стерильного песка, древесного угля и испражнений с яйцами анкилостомид, разведенную водой до полужидкой консистенции, наливают осторожно на дно цилиндра при помощи стеклянной трубки. В течение 1 - 2-суточного отстаивания в темноте при температуре 25 - 30 °С из яиц вылупляются рабдитовидные личинки, а через 5 - 7 суток они становятся уже филяриевидными: личинки выползают вверх по стенкам цилиндра, где видны даже невооруженным глазом.
Яйца трематод, естественно развивающиеся в воде, например описторхисов, дифиллоботриид, фасциол и других, помещают на часовое стекло, чашку Петри или в другой сосуд, наливают небольшой слой обычной воды. При культивировании яиц фасциол следует учесть, что они развиваются быстрее в темноте, при этом в живых яйцах при температуре 22 - 24 °С через 9 - 12 суток формируется мирацидий. При микроскопировании развивающихся яиц трематод хорошо заметны движения мирацидия. Мирацидий фасциолы из оболочек яйца выходит только на свету.
Метод Фюллеборна. Личинки анкилостомид и стронгилид культивируют на агаре в чашке Петри с животным углем. После выдерживания в термостате при температуре 25 - 30 °С в течение 5 - 6 часов личинки расползаются по агару, оставляя за собой дорожку из бактерий.
Метод Харада и Мори. В пробирки, помещенные в штатив, добавляют 7 мл дистиллированной воды. Деревянной палочкой берут 0,5 г испражнений и делают мазок на фильтровальной бумаге (15 х 150 мм) в 5 см от левого края (эту операцию проводят на листе бумаги, чтобы защитить поверхность лабораторного стола). Затем полоску с мазком вставляют в пробирку так, чтобы свободный от мазка левый конец достигал дна пробирки. Накрывают верхний конец куском целлофана и плотно обхватывают резинкой. На пробирке пишут номер, фамилию обследуемого. В таком состоянии пробирки хранят 8 - 10 суток при температуре 28 °С. Для изучения личинок снимают и удаляют целлофановую крышку и извлекают пинцетом полоску фильтровальной бумаги. При этом следует проявлять осторожность, так как небольшое количество инвазионных личинок может передвигаться к верхнему концу фильтровальной бумаги или к стенке пробирки и проникать под поверхность целлофана.
Пробирки помещают в горячую водяную баню при температуре 50 °С на 15 минут, после чего содержимое их встряхивают и быстро переливают в 15-миллилитровую пробирку для осаждения личинок. После центрифугирования надосадочную жидкость удаляют, а осадок переносят на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и микроскопируют под малым увеличением.
Для дифференциального диагноза филяриевидных личинок необходимо пользоваться данными таблицы 3.
Таблица 3
ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА ФИЛЯРИЕВИДНЫХ ЛИЧИНОК A. DUODENALE, N. AMERICANUS, S. STERCORALIS, trICHOStrONGYLUS SP.
| Личинки | Размеры | Характерные признаки |
| A. duodenale | Длина тела около 660 мкм, чехлика - 720 нм | Исчерченность чехлика менее выражена, ротовой выступ менее заметен, передний конец тела (но не чехлика) тупой, диаметр кишечной трубки меньше, чем бульбус пищевода, хвостовой конец тупой |
| N. americanus | Длина тела около 590 мкм, чехлика - 660 нм | Чехлик заметно исчерчен, особенно в хвостовой части тела, ротовой выступ кажется темным, передний конец тела (но не чехлика) закруглен подобно узкому концу куриного яйца, передняя часть кишечной трубки такого диаметра, как бульбус пищевода, хвостовой конец резко заострен |
| S. stercoralis | Длина тела около 500 мкм | Личинка без чехлика, пищевод составляет около половины длины тела, хвост тупой или разветвленный |
| Trichostrongylus sp. | Длина тела около 750 мкм | Просвет кишечника не прямой, а зигзагообразный, хвостовой конец закруглен и имеет форму кнопки |
Мертвые ткани в большинстве случаев воспринимают краски быстрее, чем живые. Эти особенности используют в гельминтологии для определения жизнеспособности яиц и личинок гельминтов. Однако в отдельных случаях некоторые краски лучше воспринимаются живыми тканями, чем мертвыми.
Для дифференциального определения живых и мертвых яиц и личинок применяют следующие краски и способы.
Для окраски живых и мертвых тканей часто используют лейкобазу метиленового синего. Живая клетка или ткань редуцирует метиленовый синий в бесцветную лейкобазу, мертвая ткань не обладает такой способностью, поэтому приобретает окраску.
Критерием состояния яйца является окрашивание зародыша, но не оболочки. Такая его способность связана с условиями гибели яйца. В тех случаях, когда волокнистая оболочка в мертвом яйце не теряет свойств полупроницаемости, она не будет пропускать красители, следовательно, мертвый зародыш не будет окрашиваться. Окрашенный зародыш всегда свидетельствует о гибели яйца.
Для окраски яиц аскарид можно использовать метиленовый синий в растворе молочной кислоты с едкой щелочью (метиленового синего 0,05 г, едкого натра 0,5 г, молочной кислоты - 15 мл). Живые яйца окраску не воспринимают; окрашиваются в синий цвет зародыши мертвых яиц. Окрашивание личинок аскарид основным раствором краски бриллианткрезилового синего в концентрации 1:10000 осуществляют следующим образом: на предметное стекло наносят каплю жидкости с яйцами аскарид и каплю основного раствора краски. Препарат накрывают покровным стеклом, которое плотно прижимают к предметному стеклу при легком постукивании препаровальной иглой. Под микроскопом наблюдают количество вышедших личинок и степень их окрашиваемости; после чего этот же препарат просматривают повторно через 2 - 3 часа. Живыми считаются только недеформированные личинки, не окрасившиеся в течение 2 часов. Мертвые личинки или не выходят из яиц, или окрашиваются при разрыве скорлупы (частично или полностью).
При определении жизнеспособности яиц аскаридий птиц возможна окраска препаратов 5%-ным спиртовым раствором йода. При его нанесении на препарат зародыши мертвых яиц аскаридий в течение 1 - 3 сек. окрашиваются в оранжевый цвет.
Мертвые яйца описторхисов и онкосферы бычьего цепня окрашиваются раствором толуидинового синего (1:1000), а мертвые онкосферы бычьего цепня - раствором бриллианткрезилового синего (1:10000). При этом приобретают цвет зародыши и оболочки как мертвых, так и живых яиц. Поэтому после окраски яйца и онкосферы отмывают в чистой воде и дополнительно окрашивают их сафранином (в разведении 1:10000 спирта 10 °С). Спирт удаляет краску с оболочек, а сафранин окрашивает в красный цвет. В результате живые яйца окрашиваются в красный цвет; яйца с мертвыми зародышами - в синий, а оболочка остается красной. Мертвые зародыши онкосфер бычьего цепня быстро, в течение нескольких минут, окрашиваются в ярко-красный или розовый цвет сафранином или в синий цвет бриллианткрезиловым синим в разведении 1:4000, или индигокармином в разведении 1:1000 - 1:2000. Живые зародыши не изменяются под влиянием этих красок даже спустя 2 - 7 часов.
Для определения жизнеспособности яиц карликового цепня рекомендуется использовать следующие краски:
1. Бриллианткреазиловый синий (1:8000) - через 1 час у мертвых яиц особенно ярко окрашивается онкосфера, которая резко выделяется на бледном или бесцветном фоне остальной части яйца.
2. Сафранин (1:8000 при воздействии в течение 2 часов и 1:5000 - в течение 3 - 5 часов).
3. 50%-ный раствор пирогалловой кислоты в разведении 1:2 - при воздействии в течение 1 часа при температуре 29 - 30 °С (чем ниже температура, тем продолжительнее процесс окрашивания).
7.7.3. Люминесцентный метод исследования яиц и личинок гельминтовЛюминесцентная микроскопия дает возможность дифференцировать живые и мертвые объекты без повреждения яйца. Для флюоресценции используются не ультрафиолетовые лучи, а сине-фиолетовая часть видимого света, с обычным микроскопом и предметными стеклами; к осветителю ОИ-18 добавляют специальный набор цветных фильтров.
Живые и мертвые яйца аскарид, остриц, карликовых цепней, бычьего цепня, широкого лентеца и других гельминтов люминесцируют неодинаково. Это явление наблюдается как при первичной люминесценции без применения красителей, так и при окраске флюорохромами (акридиновый оранжевый, корифосфин, примулин, ауролин, сульфат берлерина, трипафлавин, риванол, акрихин и др.).
Неокрашенные, живые несегментированные яйца аскарид светятся ярко-зеленым светом с желтоватым оттенком; у мертвых яиц оболочка излучает зеленый свет значительно ярче, чем темно-зеленая зародышевая часть; у яиц аскарид с личинкой проявляется только оболочка, а у мертвых - и оболочка, и личинка ярко-желтого цвета.
Непигментированные и несегментированные живые яйца остриц и карликовых цепней излучают зеленовато-желтый свет, у мертвых яиц интенсивно люминесцирует оболочка на фоне темно-зеленой зародышевой массы.
При вторичной люминесценции (при окраске акридин оранжевым в разведении 1:10000 и 1:50000 от 30 минут до 2 часов) оболочка живых и мертвых нематод, трематод и цестод люминесцирует неодинаково.
Скорлупа живых и мертвых яиц аскарид, токсокар, остриц, карликовых цепней, крысиных цепней, бычьего цепня, лентецов окрашивается в оранжево-красный цвет. Зародыши живых яиц аскарид, токсаскарисов, крысиного цепня, широкого лентеца и онкосферы бычьего цепня люминесцируют тусклым темно-зеленым или серо-зеленым цветом. Мертвые зародыши яиц этих гельминтов излучают "горящий" оранжево-красный цвет. Живые личинки остриц и токсокар (освобожденные от скорлупы яйца) излучают тусклый серо-зеленый свет, при их гибели цвет изменяется от головного конца в "горящий" светло-зеленый, затем желтый, оранжевый и, наконец, в ярко-оранжевый.
При окраске флюорохромами - корифосфилом, примулином у мертвых яиц аскарид и власоглавов наблюдается свечение от лилово-желтого до медно-красного цвета. Жизнеспособные яйца не люминесцируют, а окрашиваются в темно-зеленый цвет.
Живые яйца трематод (парагонимусов и клонорхисов) не люминесцируют после окраски акридиновым оранжевым, а от мертвых яиц исходит желтовато-зеленый цвет.
Метод люминесценции может быть применен и для определения жизнеспособности личинок гельминтов. Так, флюорохромированные раствором акридинового оранжевого (1:2000) личинки стронгилят, рабдитат светятся: живые - зеленым (с оттенком), мертвые - ярко-оранжевым светом.
Живые мирацидии, вышедшие из оболочки, излучают тусклый голубоватый свет с еле заметным светло-желтым венчиком ресничек, но спустя 10 - 15 минут после гибели проявляются ярким "горящим" светло-зеленым, а затем - оранжево-красным светом.
7.7.4. Метод биологической пробыНапример, для определения жизнеспособности яиц аскаридат (аскариды свиные, человека, токсокары, токсаскарис и др.) на одно животное (морские свинки, мыши) необходимо не менее 100 - 300 яиц с развившейся личинкой. Яйца аскаридат в изотоническом растворе натрия хлорида вводят пипеткой через рот мыши или морской свинки. Через 6 - 7 суток животное забивают, вскрывают и исследуют его печень и легкие в отдельности на наличие личинок аскаридат. Для этого печень и легкие измельчают ножницами на мелкие кусочки и исследуют их по методу Бермана или Супряги (раздел 6.1.2).
Если животных заражали живыми инвазионными яйцами, то при вскрытии в печени и легких обнаруживают мигрирующие личинки аскаридат.
В случае заражения яйца фасциол в фекалиях лабораторных животных можно обнаружить у кроликов через 2 месяца, у морских свинок - через 50 суток, у мышей - через 35 - 40 суток.
Для более быстрого получения ответа лабораторных животных вскрывают через 20 - 30 суток и исследуют печень на наличие молодых фасциол.
Для определения жизнеспособности яиц карликового цепня также рекомендуется их скармливание незараженным ими ранее белым мышам с последующим вскрытием животных через 92 - 96 часов и выявлением цистицеркоидов в кишечных ворсинках или цестод в просвете кишечника.
Для определения жизнеспособности яиц описторхисов рекомендуется метод (Герман С.М., Бэер С.А., 1984), основанный на физико-химической активации железы вылупления мирацидия и стимуляции двигательной активности личинки, что приводит к открыванию крышечки яйца и активному выходу мирацидия в экспериментальных условиях.
Взвесь яиц описторхисов в воде предварительно охлаждают до 10 - 12 °С (все последующие операции осуществляют при комнатной температуре 19 - 20 °С). В центрифужную пробирку вносят 1 каплю взвеси, содержащую 100 - 150 яиц. Пробирку ставят в штатив на 5 - 10 минут. За это время все яйца успевают опуститься на дно. Затем полоской фильтровальной бумагой осторожно отсасывают излишек воды и в пробирку добавляют 2 капли специальной среды. Среду готовят на 0,005 М Трис-HCl буфере; в буфер добавляют 12 - 13%-ный раствор этанола и краситель (фуксин, сафранин, эозин, метиленовый синий и т.д.). Пробирку встряхивают, ее содержимое переносят пипеткой на предметное стекло и оставляют на 10 минут, слегка покачивая. Затем добавляют 2 капли указанной среды. Препарат готов для микроскопирования под обычным световым микроскопом при 20-кратном увеличении.
За это время у жизнеспособных личинок открывается крышечка, и мирацидий активно выходит в указанную среду. Благодаря наличию в ней этанола, они через 2 - 5 минут обездвиживаются и затем окрашиваются с помощью красителя. Их легко можно обнаружить и посчитать при микроскопировании.
Исходный уровень знаний и навыков.
Учащийся должен знать:
1. Представителей трематод описторха, парагонима, фасциолу, дикроцелия.
2. Жизненные циклы, пути заражения трематод, клиническую картину болезни, сроки хранения фекалий
Учащийся должен уметь:
1. Определить яйца трематод по рисункам, таблицам.
2. Формировать меры профилактики.
3. Приготовить нативный мазок, большой мазок, мазок по Като, оценить свою работу, работать с микроскопом.
4. Определять яйца трематод в препаратах, соблюдать правила охраны труда, соблюдать правила сан.-эпид. режима.
Структура занятия:
Ø Микролекция.
Практическая часть:
Ø Приготовление нативного мазка, большого мазка, мазка по Като, оценка работы, микроскопия
Микролекция.
Сбор и доставка материала
Окончательный диагноз гельминтозов может быть установлен только с учетом результатов лабораторных исследований. Основным методом лабораторной диагностики гельминтозов является обнаружение яиц или личинок гельминтов в фекалиях, моче, крови и других биологических жидкостях при микроскопическом исследовании. Материалами для исследований служат испражнения, содержимое двенадцатиперстной кишки, кровь, мокрота, биопсированные ткани и другие материалы.
Сбор материала для исследования производят в чистую стеклянную или пластиковую посуду, которая сопровождается направлением с указанием ФИО обследуемого. При массовом обследовании допускается сбор фекалий в стаканчики из парафинированной бумаги, целлофановые пакеты.
Испражнения для анализов должны доставляться в лабораторию непозднее одних суток, а при подозрении на стронгилоидоз - немедленно после их выделения. При нарушении этого правила постановка диагноза в связи с разрушением яиц или личинок нередко становится трудной или невозможной.
Для выявления яиц и личинок некоторых видов гельминтов используют специальные методы: метод Бормана, перианальный соскоб, метод мазков-отпечатков с помощью липкой ленты, культивирование личинок на фильтровальной бумаге (метод Харада и Мори) и др.
Практическая часть:
Наиболее распространенным методом исследования фекалий на наличие в них яиц гельминтов являются методы нативного мазка, толстого мазка под целлофаном и большого мазка.
При изучении яиц гельминтов под микроскопом целесообразно сопоставлять видимое изображение с его характеристикой в определителе яиц гельминтов.
Метод нативного мазка
Оборудование:
предметные стекла;
широкая кювета;
пластиковые палочки;
карандаш;
50 %-ный водный раствор глицерина (смешивают равные части глицерина и дистиллированной воды);
сосуд с 0,5% -ным раствором полидеза;
микроскоп.
Ход работы
1. Разложить предметные стекла в кювете, пронумеровать предметные стекла.
2. Нанести пипеткой по 2 капли 50 %-ного водного раствора глицерина на расстоянии 4 см одна от другой на предметные стекла.
3. Взять палочкой кусочек фекалий, размером со спичечную головку (30-50 мг), внести его в каплю глицерина и растереть до равномерной суспензии.
4. На каждом стекле готовят по два нативных мазка, которые не должны сливаться между собой и не доходить до краев, чтобы не испачкать пальцы лаборанта. Для каждой пробы используют новые палочки.
5. Препараты, не накрывая покровными стеклами, исследовать под микроскопом (объектив 8х, окуляр 10-15х).
6. По окончании исследования погрузить препараты в сосуд с 0,5% -ным раствором полидеза.
Метод толстого мазка под целлофаном.
Метод предложен К. Като, М. Миуром в 1954 г. Мазок представляет собой слой неразбавленных фекалий на предметном стекле, спрессованный под листком тонкого гигроскопического целлофана, пропитанного глицерином.
Рис. Приготовление толстого мазка под целлофаном:
а - нативный мазок; б - придавливание резиновой пробкой комочка фекалий, покрытых целлофаном; в - толстый мазок под целлофаном (по Ю.А. Березанцеву и Е.Г.Автушенко, 1976)
Оборудование:
широкая кювета;
полоски целлофана 22x30 мм, обработанные смесью Като в течение 24 ч;
смесь Като (3 % -ный раствор малахитового зеленого -6 мл, 6 % -ный раствор фенола - 500 мл, глицерин - 500 мл, 3,5 мл смеси хватает на 100 полосок);
резиновые пробки крупные;
пинцет анатомический;
пластиковые палочки;
карандаш;
микроскоп.
Ход работы
1. Разложить в кювете предметные стекла, пронумеровать предметные стекла.
2. Набрать палочкой фекалии размером с полгорошины (50-60 мг) и поместить на предметное стекло в центр.
3. Достать из банки пинцетом целлофановую полоску, обработанную по Като, и наложить на пробу кала на предметном стекле.
4. Придавить целлофан резиновой пробкой, чтобы кал распределился равномерно, не вытекая за края полоски.
5. Оставить препарат до просветления на 60 мин и затем исследовать под микроскопом (объектив 8-40х, окуляр 10х).
6. По окончании исследования препарат опустить в сосуд с 0,5 %-ным раствором полидеза.
7. Убрать рабочее место, вымыть руки.
Метод большого мазка.
Метод был предложен Ю.А. Березанцевым и Е.Г. Автушенко в 1973 г. Суть метода основывается на применении бинокулярного микроскопа и нативного мазка на стекле 6x9 см, позволяющего одномоментно исследовать до 200-300 мг кала.
Оборудование:
предметные стекла 6x9 см и 7x10 см;
пластиковые палочки;
50 %-ный раствор глицерина (глицерин и дистиллированная вода в равных частях);
сосуд с 0,5 %-ным раствором полидеза;
микроскоп;
эмалированная кювета;
карандаш.
Ход работы
1. Разложить предметные стекла 7x10 см в кювете, пронумеровать предметные стекла.
2. Затем на каждое предметное стекло положить второе предметное стекло 6x9 см.
3. Нанести пипеткой на предметное стекло размером 6x9 см 15-20 капель 50 % -ного раствора глицерина.
4. Взять палочкой из разных мест кусочки кала величиной со среднюю горошину (200-300 мг) и опустить его в раствор 50 %-ного глицерина на предметном стекле.
5. Растереть палочкой кусочек кала в глицерине до равномерной суспензии, чтобы занимаемая им площадь составляла около 33-34 см 2 . Мазок не покрывать покровными стеклами.
6. Взять большое покровное стекло 7x10 см за края вместе с находящимся на нем большим мазком (чтобы не запачкать пальцы).
7. Исследовать большой мазок при увеличении 34х (объектив 2х, окуляр 17х) и 50х (объектив 4х, окуляр 12,5х). В сомнительных случаях исследования проводят на большом увеличении.
8. По окончании исследования препарат опустить в сосуд с 0,5 %-ным раствором полидеза.
9. Убрать рабочее место, вымыть руки.
При таком методе исследования определяются крупные яйца гельминтов (аскариды, власоглава, анкилостомид, острицы, лентеца широкого, тениид, фасциолы). Они выглядят несколько иначе, в связи с чем необходим некоторый опыт, чтобы их быстро обнаружить. Большие мазки можно применять для исследования на яйца шистосом и личинок угрицы кишечной. Большой мазок содержит в 6-10 раз больше исследуемого материала, чем нативный мазок. Во столько же раз выше его эффективность.
Похожая информация.
Прежде чем проводить лечебно-профилактические мероприятия при определенных гельминтозах сельскохозяйственных и промысловых животных, необходимо своевременно поставить точный диагноз болезни. Существуют две группы методов диагностики гельминтозов - прижизненные и посмертные. Кроме того, надо уметь дифференцировать гельминтозы и другие инвазионные, а также инфекционные заболевания.
Прижизненная диагностика гельминтозов
Диагноз на гельминтозы при жизни животных ставят на основании результатов лабораторных методов исследований и диагностических дегельминтизаций (прямых методов), а также иммунобиологических реакций (косвенных методов). Подсобную роль в диагностике гельминтозов играют данные исследований промежуточных хозяев (при биогельминтозах), клинические и эпизоотологические наблюдения. Основные методы диагностики - лабораторные исследования, позволяющие часто обнаруживать возбудителей гельминтозов или их яйца и личинки в экскретах (фекалиях, моче, мокроте), секретах (желчи), тканях (крови, мышцах), органах (кусочках кожи), в содержимом пунктатов и абсцессов.
Лабораторные методы диагностики гельминтозов животных легко выполнимы и достаточно точны, поэтому их широко применяют в производственных условиях (в ветеринарных лабораториях и в других ветеринарных учреждениях). В зависимости от целевого назначения лабораторные исслелования подразделяют на гельминтоовоскопические, гельминтоларвоскопические и гельминтоскопические методы исследований.
Гельминтоларвоскопические методы исследований используют для обнаружения личинок гельминтов (диктиокаул, мюллерий и др.). Из этой группы нередко применяют исследование фекалий по методам Бермана-Орлова и Вайда.
Гельминтоскопические или макрогельминтоскопические исследования применяют с диагностической целью для обнаружения выделяемых наружу гельминтов или их фрагментов (члеников нестод). В практических условиях этим способом устанавливают диагноз на аскаридоз свиней, дрепанидотениоз гусей и другие гельминтозы.
Из лабораторных методов диагностики гельминтозов животных большое практическое значение имеют: а) гельминтокопрологические исследования (исследование фекалий); б) исследование выделений других органов; в) исследование тканей.
Гельминтокопрологические исследования
Для этих же целей предложен специальный прибор, состоящий из стальных браншей, переходных ветвей и двух прикрепленных к ветвям полусферических поверхностей. Взятие фекалий из прямой кишки животных при помощи этого прибора облегчает труд ветеринарных работников и повышает производственную культуру этой манипуляции.
У кроликов фекалии в количестве нескольких шариков извлекают путем надавливания на брюшную стенку в области прямой кишки. Иногда допускается взятие проб фекалий с пола, если они свежие и известно, от какого животного. От одного животного берут не менее 10-20 г фекалий. От птиц, пушных зверей, собак, кошек и диких хищников (в зоопарках) фекалии собирают с чистого пола клеток (групповые пробы).
Все пробы фекалий этикетируют: по краю пакета или листа бумаги (где он не будет соприкасаться с экскрементами) простым карандашом пишут номер пробы (иногда и кличку коров). К пробам фекалий прилагают опись, в которой указывают наименование хозяйства, бригады, вид, пол и возраст животных (для взрослых - кличку или инвентарный номер) и дату взятия проб. В сопроводительной желательно указать цель исследований фекалий (например, для контроля проведенной дегельминтизации). Необходимо стараться быстрее доставить пробы фекалий в ветеринарную лабораторию и исследовать их без задержки, потому что при комнатной температуре через 16-20 часов из яиц кишечных стронгилят выходят личинки, что затрудняет диагностику диктиокаулеза и протостронгилидозов, а также других гельминтозов.
Если пробы фекалий в день взятия не исследуют, то их помещают в холодильник или подвал при температуре не выше 10°. Дезинфицирующие средства не приостанавливают развитие личинок внутри яиц гельминтов. Результаты исследования фекалий регистрируют в специальном журнале.
Оборудование для гельминтокопрологических исследований. Достоверность гельминтокопрологических исследований в значительной степени зависит от качества лабораторного оборудования. В 1968 г. на Украине разработан набор стандартного оборудования для массового исследования фекалий на гельмннтозы. Он состоит из предметов, изготовленных преимущественно из ударопрочного полистерола двух цветов, которые легко моются и обезвреживаются (выдерживают кипячение), а также удобны при транспортировке. В состав набора входят стаканчики различной емкости, воронки, конические пробирки, ситечки разных размеров, штатив с пятью планками (каждая на шесть воронок), кювет (по размерам штатива), коробки для хранения посуды, а также резиновые груши, стеклянные палочки и металлические петли (рис. 1).
В отличие от ранее применявшегося разнородного оборудования новый набор повышает эффективность лабораторных исследований фекалий и производительность труда ветеринарных работников, позволяет шире проводить количественные гельминтокопрологические исследования стандартизированными методами (контроль дегельминтизаций), а также улучшает эстетическую сторону этой работы.
Различают качественные и количественные методы исследований фекалий.
Качественные гельминтокопрологические исследования
Качественные методы исследований позволяют установить, какими гельминтами заражены животные.
Гельминтоовоскопические методы. Для прижизненной диагностики гельминтозов предложено большое количество методов гельминтоовоскопии, из которых рассмотрим только те, которыми чаще пользуются в ветеринарной практике.
Большинство гельминтокопрологических методов диагностики основано на разнице удельного веса яиц, личинок гельминтов или их фрагментов, с одной стороны, и жидкости, в которой взвешены исследуемые фекалии, - с другой. В зависимоти от соотношения удельного веса этих компонентов различают методы флотации, осаждения и комбинированные.
Методы флотации. При методах флотации (всплывания) используют жидкости (насыщенные растворы солей), удельный вес которых больше веса яиц гельминтов. В лабораторной практике наиболее широко применяют насыщенный раствор поваренной соли (удельный вес 1,18). Для приготовления такого раствора в кастрюлю с кипящей водой постепенно добавляют при помешивании хлорид натрия до образования на дне небольшого осадка (на 1 л воды берут около 400 г поваренной соли). Горячий раствор фильтруют в бутыль через несколько слоев марли или вату и применяют после остывания (на дне бутыли должен образоваться кристаллический осадок).
Реже в ветеринарных лабораториях используют насыщенные растворы сульфата магния с удельным весом 1,35 (920 г на 1 л горячей воды), гипосульфита натрия с удельным весом от 1,37 до 1,41, в зависимости от температуры окружающей среды (1750 г на 1 л горячей воды) и азотнокислого натрия с удельным весом 1,4 (соотношение селитры и горячей воды 1:1).
Метод Фюллеборна характеризуется простотой выполнения и высокой эффективностью при большинстве нематодозов и цестодозов животных, поэтому он занимает первое место среди других, гельминтокопрологических методов диагностики. В стеклянный, полистероловый или пластмассовый стаканчик емкостью 50-100 мл помещают 3-5 г фекалий и при помешивании стеклянной палочкой постепенно добавляют насыщенный раствор поваренной соли (хлорида натрия) из расчета на одну часть фекалий 15-20 частей флотационной жидкости. Плотные фекалии овец предварительно можно растереть с небольшим количеством раствора соли в фарфоровой ступке, после чего суспензию переливают в стаканчик, добавив необходимое количество раствора хлорида натрия. Всплывшие крупные частицы сразу удаляют палочкой, а взвесь фекалий целесообразно профильтровать в другой стаканчик через сито (иногда употребляют молочные ситечки). После отстаивания заряженной пробы в течение 45-60 минут металлической петлей снимают три капли поверхностной пленки, помещают их на предметное стекло и микроскопируют без покровного стекла. После каждой пробы петли промывают в стакане с водой (вместо рекомендуемых в некоторых руководствах прожиганий их на спиртовке).
Метод Калантарян - видоизмененный метод Фюллеборна. В качестве флотационной жидкости используют насыщенный раствор азотнокислого натрия. Время отстаивания взвеси 15-30 минут. Применяют для диагностики и акантоцефалезов.
Методы осаждения. При методах осаждения используют жидкости с меньшим удельным весом, чем удельный вес яиц.
Метод последовательного промывания. Небольшое количество фекалий (5 г) размешивают в стаканчике с 10-кратным количеством воды. Смесь фильтруют в большой стакан и доливают воду, после чего фильтрат отстаивают 5 минут. Затем сливают или отсасывают спринцовкой верхний слой жидкости до осадка; к осадку добавляют такое же количество воды, перемешивают и отстаивают снова 5 минут. Эти манипуляции повторяют до просветления верхнего слоя жидкости в стакане. Жидкость последний раз сливают, а осадок наносят на стекло или в бактериологическую чашку и исследуют под микроскопом. Этот метод часто применяют для диагностики большинства трематодозов и акантоцефалезов.
Метод Горшкова основан на принципе осаждения с последующей концентрацией яиц гельминтов. 150-300 г фекалий лошади помещают на металлическое сито или марлю в большую стеклянную воронку диаметром в верхней части 15-20 см. На нижний конец воронки надевают резиновую трубку длиной 10-15 см с зажимом на конце. Фекалии разрыхляют и заливают доверху теплой водой. Фекалии в воронке выдерживают от 4 часов до одних суток, после чего зажим осторожно открывают, часть жидкости выпускают в центрифужные пробирки и центрифугируют 3 минуты. Затем жидкость сливают, а осадок исследуют под микроскопом. Этим методом диагностируют драшейоз и габронематоз лошадей.
Комбинированные методы. Основаны на принципе осаждения и флотации яиц гельминтов, поэтому более эффективны в сравнении с предыдущими методами исследований. Ввиду сложности эти методы имеют сравнительно ограниченное применение в производственных условиях.
Метод Дарлинга. Небольшое количество фекалий (3-5 г) размешивают в стаканчике с 20-30 мл воды, смесь процеживают в центрифужные пробирки и центрифугируют 1-2 минуты, после чего верхний слой жидкости сливают, а к осадку доливают смесь равных частей глицерина и поваренной соли. Смесь в пробирках взбалтывают и вторично центрифугируют. Всплывшие на поверхность яйца снимают вместе с пленкой взвеси проволочной петлей, стряхивают на предметное стекло и микроскопируют. При отсутствии глицерина фекалии можно смешивать перед вторичным центрифугированием с насыщенным раствором поваренной соли.
Метод Щербовича. Техника исследования фекалий напоминает предыдущий метод. Отличается от него тем, что перед вторичным центрифугированием к осадку добавляют насыщенный раствор гипосульфита натрия (при макраканторинхозе свиней) или сернокислой магнезии (). По сравнению с методом Дарлинга этот метод более эффективен.
Флотационно-седиментационный метод Демидова рекомендуют для диагностики фасциолеза, а также других трематодозов жвачных. Пробу фекалий (3 г от овец и 5 г от крупного рогатого скота) помещают в стакан емкостью 200 мл и наливают в него доверху насыщенный раствор поваренной соли и тщательно размешивают стеклянной палочкой, после чего взвесь отстаивают 15-20 минут. Всплывшие на поверхность грубые частицы удаляют бумажным совочком, а надосадочную жидкость отсасывают спринцовкой (при исследовании большого количества проб жидкость можно сливать), оставляя на дне 20-30 мл осадка. К осадку доливают воду до полного объема стакана и тщательно размешивают. Смесь фильтруют в обычный стакан через марлю или металлическое сито и отстаивают 5 минут. Надосадочную жидкость отсасывают, оставляя на дне 15-20 мл осадка, который переносят в конический стаканчик, пропаласкивают обычный стакан и выливают смыв в маленький. Взвесь отстаивают в коническом стаканчике 3-5 минут, а жидкость в последующем отсасывают (эту процедуру повторяют). Просветленный осадок переносят на предметное стекло и микроскопируют. Этот метод эффективнее метода последовательного промывания.
Гельминтоларвоскопические методы. Метод Бермана-Орлова. Для исследования фекалий используют аппарат, состоящий из средней воронки (пластмассовой, полистероловой или стеклянной), резиновой трубки (10-15 см длиной), соединенной верхним концом с воронкой, зажима, укрепленного на нижнем конце резиновой трубки, металлического сита или куска марли и штатива (для одного или нескольких аппаратов). Смонтированный аппарат заполняют теплой водой (35-38°). 10-15 г свежих фекалий кладут на сито или завертывают в марлю и осторожно опускают в воронку. Фекалии от овец выдерживают в аппарате 2-4 часа, а от телят - не менее 6-7 часов. Затем зажим на трубке ослабляют, а вытекающую жидкость собирают в пробирку и центрифугируют в течение 2-3 минут. После этого верхний слой жидкости сливают быстрым опрокидыванием пробирки, а оставшуюся на дне жидкость переносят на предметное стекло и исследуют под микроскопом. Применение зажимов на резиновую трубку в аппарате Бермана связано с неудобствами, поэтому во многих ветеринарных лабораториях нижние концы резиновых трубок непосредственно соединяют с маленькими пробирками. Перед исследованием осадка под микроскопом жидкость не центрифугируют.
Фекалии жвачных можно исследовать на легочные нематодозы (особенно в экспедиционных условиях) упрощенным методом гельминтоларвоскопии (без использования воронок). Для этой цели применяют небольшие полуконические стаканчики (50 мл). Пробы фекалий помещают на ситечки или завертывают в марлю и опускают в стаканчики с водой. Через несколько часов фекалии удаляют, жидкость из стаканчика отсасывают или сливают, а осадок микроскопируют.
Метод Вайда. Несколько шариков фекалий от мелких жвачных помещают в бактериологическую чашку или на часовое стекло и овлажняют их небольшим количеством теплой воды. Через 10-20 минут фекалии удаляют, а оставшуюся жидкость исследуют под малым увеличением микроскопа. Эффективность этого метода значительно ниже в сравнении с предыдущим методом, поэтому его реже применяют для диагностики диктиокаулеза и протостронгилидозов овец.
Метод дифференциальной диагностики стронгилятозов по инвазионным личинкам. Возбудители большинства кишечных стронгилятозов имеют почти одинаковое строение яиц, поэтому при гельминтоовоскопии можно поставить только групповой диагноз (например, стронгилятозы).
Для установления более точного диагноза (родового) в ветлабораториях иногда получают культуру инвазионных личинок стронгилят. Около 5 г фекалий помещают в бактериологическую чашку, закрывают крышкой и ставят ее в термостат при температуре 25-30° на одну неделю. Затем фекалии с личинками исследуют по методу Бермана-Орлова (для выделения инвазионных личинок из фекалий).
Инвазионные личинки разных родов кишечных стронгилят отличаются по величине тела, строению хвостового конца чехлика и по количеству кишечных клеток. Например, личинки эзофагостом более крупные (до 1 мм длины), нитевидный хвостовой конец чехлика длинный, а кишечник имеет 20-32 клетки; личинки гемонхов средней длины (около 0,8 мм), с нитевидным хвостовым концом чехлика, кишечник имеет 16 клеток.
Периодическое промывание и отстаивание фекалий повторяют до просветления верхнего слоя. Верхний слой жидкости последний раз сливают, а осадок малыми порциями просматривают в кюветках с черным и белым дном. Обнаруженных гельминтов собирают при помощи пинцетов, препаровальных игл и кисточек, просматривают под микроскопом, после чего переносят в консервирующую жидкость. Чтобы выявить мелких нематод, осадок дополнительно исследуют по частям при помощи бинокулярной или штативной лупы с 10-20-кратным увеличением.
Количественные гельминтокопрологические исследования
Стандартизированный метод Фюллеборна менее точен в сравнении с методом Столла, но в виду простоты выполнения его широко применяют в ветеринарной практике для контроля эффективности дегельминтизаций животных. По технике выполнения стандартизированный метод напоминает другие методы качественных гельминтоовоскопических исследований. Однако у него имеется ряд особенностей, основными из которых являются следующие: 1) навески фекалий должны быть равными; 2) посуда одного обьема; 3) время отстаивания водных взвесей фекалий одно и то же; 4) петли одинакового диаметра, исследование равного количества капель.
Для ориентировочного учета интенсивности диктиокаулезной и прогостронгилидозной инвазии у жвачных можно применить стандартизированный метод Бермана-Орлова. Достоверность результатов повышается при увеличение количества и кратности исследований.
Исследование выделений других органов
Исследование содержимого конъюнктивальных полостей применяют для диагностики телязиоза крупного рогатого скота (возбудитель - Thelazia rhodesi). Из спринцовки орошают конъюнктивальные полости водным раствором йода; вытекающую жидкость собирают в кюветку или почковидный тазик и осматривают на наличие телязий. В данном случае водный раствор йода оказывает и лечебное действие.
Исследование истечений из клоаки проводят для прижизненной диагностики . Вытекающую слизь помещают на предметное стекло и исследуют под микроскопом с целью обнаружений яиц возбудителя болезни.
Исследование соскоба с перианальных складок - основной метод диагностики . Лопатковидной палочкой или спичкой, смоченной смесью равных частей глицерина и воды, делают соскоб с перианальных складок промежности и внутренней поверхности корня хвоста. Соскоб переносят на предметное стекло в каплю глицерина с водой, накрывают покровным стеклом и микроскопируют. Обнаружение яиц оксиур подтверждает клинический диагноз.
Исследование соскобов кожи из «летних язв» рекомендуется для диагностики кожной формы драшейоза и габронематоза. Соскоб берут со свежеизъязвленной поверхности кожи и помещают в каплю разведенной соляной кислоты (1:1000). Затем препарат расщепляют препаровальными иглами, накрывают покровным стеклом и исследуют под микроскопом для обнаружения личинок драшей или габронем.
Исследование тканей
Исследование кожи крупного рогатого скота (по Гнединой) применяют для диагностики онхоцеркоза. На нижней брюшной стенке у животного после подготовки операционного поля вырезают небольшой кусочек кожи толщиной 2 мм (с небольшое овсяное зерно), а ранку смазывают настойкой йода. В ветеринарной лаборатории этот кусочек кожи помещают на предметное стекло в физиологический раствор, расщепляют препаровальными иголками, а затем все сливают в центрифужную пробирку и ставят ее на несколько часов в термостат при температуре 37-38°. Затем волокна кожи удаляют, жидкость центрифугируют, а осадок микроскопируют с целью обнаружения подвижных микроонхоцерков.
Исследование кусочков мышц на часто проводят посмертно. Иногда для прижизненной диагностики трихинеллеза используют метод биопсии. Путем оперативного вмешательства вырезают кусочек мышцы (например, из наружных мышц уха), из которых готовят мелкие срезы (с овсяное зерно). Последние помещают на нижнее стекло компрессория, покрывают верхним стеклом и сближают их винтами до полного расплющивания. Просматривают срезы под трихинеллоскопом, малым увеличением микроскопа, с помощью проекционного трихинеллоскопа или проекционной камеры КТ-3.
Диагностические дегельминтизации
Для диагностической дегельминтизации отбирают несколько животных, изолируют от остального поголовья и задают им антгельминтик в терапевтической дозе. Выделенные в течение одних-двух суток фекалии от этих животных собирают и подвергают гельминтоскопическому исследованию на предмет обнаружения возбудителя болезни. В производственных условиях диагностические дегельминтизации нередко проводят для прижизненной диагностики мониезиоза жвачных, дрепанидотениоза гусей, цестодозов плотоядных, аскаридоза свиней и аскаридиоза кур.
Иммунологические реакции
Аллергические кожные реакции предложены для прижизненной диагностики фасциолеза овец, описторхоза плотоядных, и , мониезиоза овец, гемонхоза и диктиокаулеза овец, онхоцеркоза крупного рогатого скота и лошадей и трихинеллеза свиней.
Из серологических методов следует указать на реакцию сколексопреципитации, позволяющую диагностировать ранние стадии эхинококкоза и реакцию преципитации с использованием живых личинок аскарид и трихинелл для выявления соответствующих гельминтозов.
Исследование промежуточных хозяев гельминтов
Результаты гельминтологического обследования животных всегда должны дополняться данными исследований на гельминтозы промежуточных хозяев. Они позволяют выяснять гельминтологическую ситуацию, прогнозировать появление гельминтозов. Промежуточными хозяевами гельминтов могут быть моллюски (пресноводные и сухопутные), ракообразные (циклопы, дафнии, бокоплавы, водяные ослики), дождевые черви, насекомые (мухи, мошки, мокрецы, стрекозы, муравьи, жуки), почвенные клеши.
Эпизоотологическое значение имеет плотность (количественный состав) отдельных видов промежуточных хозяев. Чем она выше, тем больше имеется возможностей для заряжения животных гельминтозями. Наземные промежуточные хозяева находятся в разных местах (в навозных кучах, на выгулах, пастбищных участках и др.). Водные промежуточные хозяева в огромном количестве обитают у берегов стоячих мелких водоемов, в зарослях растений. В этих местах животные (особенно ) часто заражаются гельминтозами.
Промежуточных хозяев на наличие личинок гельминтов надо исследовать в свежем (лучше живом) состоянии под бинокулярной лупой или малым увеличением микроскопа. Личиночные стадии гельминтов в теле промежуточных хозяев находятся на разных стадиях развития, но наиболее заметными являются инвазионные личинки. В итоге исследований определяется экстенсивность (процент) и интенсивность (количество) инвазированности промежуточных хозяев личинками определенных видов гельминтов.
Орибатидные или панцирные, клещи (до 1 мм длины). Обитают в верхних слоях почвы. Это промежуточные хозяева мониезий жвачных и других гельминтов. Для обнаружения личинок ленточных червей (цистицерроидов) предварительно в капле воды на предметном стекле (под контролем лупы) расщепляют на части панцирь орибатидного клеща, затем препарат покрывают покровным стеклом и микроскопируют. Цистицеркоиды мониезий округлой формы (0,15-0,19 мм в диаметре), снабжены четырьмя присосками и хвостовым придатком. Они очень нежные, поэтому не следует применять метод компрессорного исследования клещей.
Дождевые черви других родов (Criodrilus, Eophila) обитают в водоемах с топкими, илистыми берегами. Они зарегистрированы в качестве промежуточных хозяев возбудителей гистрихоза и порроцекоза уток. Личинка гистрихиса очень крупная (до 3 см длины), беловатого цвета, просвечивает сквозь кожные покровы червя в виде волнистой полосы. Личинки порроцекумов в десять раз меньше предыдущей личинки (2,5-3 мм); они обнаруживаются в кровеносных сосудах при компрессорном исследовании дождевых червей под микроскопом.
Исследование бокоплавов. Бокоплавы достигают длины до 2 см, обитают в морских и пресноводных водоемах. Зарегистрированы они в качестве промежуточных хозяев возбудителей полиморфоза. стрептокароза и тетрамероза птиц. Личинок обнаруживают при компрессорном исследовании этих рачков. Личинки (акантеллы) полиморфуса овальной формы, оранжевого цвета, до 1 мм длины, заметны макроскопически.
Исследование водяных осликов. Водяные ослики от 1 до 1,5 см длины, живут в пресноводных водоемах, являются промежуточными хозяевами возбудителя филиколлеза птиц. При компрессорном исследовании можно выявить личинку (акантеллу) белого цвета, овальной формы, 0,7 мм длины.
Можно также исследовать и других промежуточных хозяев (мошек, мокрецов, мух, стрекоз, жуков, муравьев).
Люминесцентная микроскопия
Метод люминесцентной микроскопии (по В. Г. Эврановой) - новый метод диагностики гельминтозов. Он позволяет дифференцировать однотипные яйца разных видов гельминтов, а также отличать жизнеспособные яйца и личинки от мертвых. Предварительно яйца трематод, цестод и нематод обрабатывают растворами акридина оранжевого и другими флуорохромами. Жизнеспособные яйна и личинки нематод не люминесцируют или слабо люминесцируют, в то время как мертвые ярко светятся и окрашены в оранжевый, желто-зеленый или желтый цвет.
При люминесцентной микроскопии можно дифференцировать яйца главнейших цестод плотоядных, яйца возбудителей и гетеракидоза кур, имеющих, как известно, сходное строение по величине, форме и окраске, а также различать жизнеспособные и мертвые ооцисты кокцидий.
Препараты просматривают под микроскопом МУФ-3 или МЛ-2. Методика люминесцентной микроскопии сравнительно проста и может быть использована в производственных условиях (ветеринарных лабораториях).
Из других исследований, имеющих подсобное значение в установлении диагноза на гельминтозы. можно указать на такие, как выяснение морфологического состава крови (учет эозинофилии), метод определения фракции белков.
Краткая характеристика яиц гельминтов
Яйца представителей разных классов различаются по величине, цвету, форме, строению оболочек и внутреннего содержимого.
Яйца трематод. Чаще овальной формы с крышечкой на одном полюсе. Оболочка гладкая. У некоторых видов оболочка снабжена филаментами (отростками), бугорками. Окраска яиц от светло-серой до коричневой (чаще желтая).
Яйца цестод. Бывают двух типов: лентецов и цепней. У лентенов они напоминают яйца трематод (овальные с крышечкой). Яйца цепней резко отличаются по строению от яиц гельминтов других классов: они чаще средней величины, округлой формы, серого цвета, зрелые (внутри зародыш - онкосфера с тремя парами эмбриональных крючьев).
Яйца нематод. Отличаются от яиц трематод отсутствием крышечки; от яиц цестод - отсутствием онкосферы.
Размеры, форма, строение и цвет оболочек яиц нематод очень разнообразны. Наружная оболочка бывает гладкой, бугристой, ячеистой: толщина оболочек варьирует от тонкой (у стронгилят) до толстой (у трихоцефал). У большинства нематод яйца овальной формы, симметричные, у некоторых - получилиндрические (у драшей). Большинство нематод выделяют наружу незрелые яйца на предсегментационной стадии или нескольких шаров дробления, меньшинство - зрелые (внутри яйца сформирована личинка).
Яйца скребней. Они имеют овальную, эллипсоидную и веретенообразную формы: размер их от среднего до крупного. Выделяемые во внешнюю среду яйца содержат внутри личинку - акантор с десятью эмбриональными крючьями (зрелые).
Клинические наблюдения
Эпизоотологические данные
При диагностике многих гельминтозов сельскохозяйственных животных значительную помощь оказывают эпизоотологические данные (неблагополучие хозяйства по конкретным болезням, сезон года, возраст больных животных, характер пастбищ и водоисточников, метеорологические условия и др.). Например, массовое заболевание с признаками брюшных водянок и падеж овец осенью после дождливого лета и использование под выпасы заболоченных участков пастбищ дает основание заподозрить острую форму фасциолеза. Заболевание гусят летом с признаками расстройства пищеварения (поносы) и нервной системы (парезы) после выпаса их на мелком стоячем водоеме, обильно заселенном циклопами, является основанием для установления предполо-жительного диагноза на дрепанидотениоз. Падеж ягнят весной (через 3-4 недели после начала пастбищного содержания) должен вызвать подозрение о заболевании молодняка овец мониезиозом. Необходимо также учитывать зональные особенности гельминтозов домашних животных, желательно в комплексе с клиническими наблюдениями.
Эффективным и удобным методом гельминтологического исследования является изучение толстого мазка по Като , сущность которого состоит в обнаружении яиц гельминтов в толстом мазке фекалий, просветленных глицерином и подкрашенных малахитовой зеленью. Состав смеси Като - 6 мл 3% водного раствора малахитовой зелени, 500 мл глицерина, 500 мл 6% раствора фенола. Раствор стабилен, может храниться при комнатной температуре. Для приготовления препаратов кусочки фекалий величиной с горошину наносят на предметное стекло, покрывают пленкой гидрофильного целлофана, выдержанного в смеси Като в течение 24 ч, и придавливают его к стеклу для равномерного распределения материала. Просветленные в течение 40-60 мин мазки микроскопируют. Подсчитывают обнаруженные яйца гельминтов и по морфологическим признакам определяют их видовую принадлежность. Метод позволяет выявить яйца аскарид, власоглава, цестод, трематод, в меньшей степени - анкилостомид и карликового цепня.
Широко применяются также методы обогащения
. Принцип флотационных методов состоит в суспендировании фекалий в солевом растворе, имеющем большую относительную плотность по сравнению с яйцами гельминтов, вследствие чего они всплывают на поверхность. Под микроскопом исследуется содержимое поверхностной пленки. В качестве обогатительных смесей используют растворы: поваренную соль - 400 г в 1 л воды (относительная плотность по Фюллеборну -1,18); азотнокислый натрий - 1 кг в 1 л воды (относительная плотность по "Калантарян-1,38); азотнокислый натрий - 900 г и азотнокислый калий - 400 г в 1 л воды (относительная плотность по Брудастову и Красноносу-1,48). Приготовленные растворы кипятят и охлаждают.
Для исследования вносят 5-10 г фекалий в стеклянный или фаянсовый стакан, добавляют в него 100-200 мл солевого раствора и тщательно размешивают. Затем удаляют всплывшие крупные частицы деревянным шпателем или совочком из бумаги либо картона и тотчас же прикладывают к поверхностной пленке широкое предметное стекло так, чтобы солевой раствор и предметное стекло полностью соприкасались. После 30-40-минутного отстаивания смеси предметное стекло снимают, кладут под микроскоп пленкой кверху и тщательно просматривают всю поверхность. Во избежание высыхания можно добавить 2-3 капли 50% раствора глицерина. Поверхностную пленку можно снимать также проволочной петлей. Эффективность флотационных методов повышается по мере увеличения относительной плотности солевых растворов. С помощью этих методов можно выявлять яйца нематод, цестод и трематод.
Для обнаружения яиц в фекалиях применяют метод седиментации по Красильникову
. Фекалии смешивают с 1 % раствором детергента (стиральный порошок «Лотос» и др.) в соотношении 1:10 до образования суспензии. Под влиянием детергента растворяются различные компоненты фекалий (белки, жиры, тканевые элементы). Через 30 мин содержимое пробирки встряхивают в течение 1-2 мин, после чего центрифугируют 5 мин. Из осадка готовят препараты и просматривают под микроскопом.
В полевых условиях, а также при массовых обследованиях населения на пораженность гельминтами удобно применять метод толстого мазка по Като. В стационарных условиях при обследовании больных предпочтительнее использовать наиболее эффективные флотационные методы. При использовании этих методов в ходе микроскопии целесообразно подсчитывать обнаруженные в препарате яйца. При соблюдении стандартности навески или объема, взятых для исследования фекалий (например, 1 чайная или столовая ложка), и постоянного единого объема солевых растворов можно ориентировочно судить об интенсивности инвазий. Этот количественный учет может быть полезным при обосновании назначенного лечения и оценке эффективности проведенной дегельминтизации. Кроме того, для установления интенсивности инфекции могут быть использованы и другие более точные количественные методы, в частности метод Столла.
Для диагностики тениаринхоза и энтеробиоза применяют метод исследования перианально-ректальных соскобов. Деревянным шпателем, смоченным в 50% растворе глицерина, делают соскоб с перианальных складок утром до дефекации в окружности заднего прохода и нижних отделов прямой кишки. Полученный материал, очищенный со шпателя краем покровного стекла, помещают на предметное стекло в каплю 50% раствора глицерина, накрывают покровным стеклом и исследуют под микроскопом. Можно исследовать также полоску целлюлозной ленты, которую вначале прижимают клейкой стороной к пернанальным складкам, затем помещают на предметное стекло и микроскопируют.
Обнаружение личинок нематод в фекалиях по методу Бермана . Метод основан на термотропном свойстве личинок. Для исследования берут 1 столовую ложку фекалий, помещают их в металлическую сетку или сетку из нескольких слоев марли на проволочном каркасе. Сетку устанавливают в воронку, укрепленную в штативе. К воронке присоединяется резиновая трубка с зажимом. Приподняв сетку, воронку заполняют водой (температура +40°...+50°С) так, чтобы нижняя часть сетки была погружена в воду. Личинки из фекалий активно мигрируют в теплую воду и, оседая, скапливаются в нижней части воронки. Через 2-4 ч зажим открывают, воду спускают в центрифужную пробирку и центрифугируют в течение 2-3 мин. Затем сливают надосадочную жидкость, осадок переносят на предметное стекло и просматривают под микроскопом, где отыскивают подвижные личинки возбудителя стронгилоидоза.
Метод Харада и Мори позволяет дифференцировать личинки анкилостом и некаторов. Личинки анкилостомид культивируют на фильтровальной бумаге. С этой целью 0,5 г свежих фекалий, взятых у больного не позже чем через 1 ч после дефекации, наносят на полоски фильтровальной бумаги, размером 12X1,5 см, оставляя оба конца полоски чистыми. Один конец полоски погружают в пробирку, четвертая часть которой заполнена водой, а другой - зажимают пробкой. Пробирки ставят в термостат при температуре +26... + 28°С. Развившиеся из яиц личинки опускаются по фильтровальной бумаге и оседают на дно пробирки. Спустя 5-6 дней полоску бумаги удаляют, а оставшуюся в пробирке жидкость исследуют под лупой либо центрифугируют. Образовавшийся при центрифугировании осадок исследуют под световым микроскопом. При использовании вместо пробирок четырехгранных стеклянных банок (размером 15ХЮХ7 см), к стенкам которых прикрепляют по 4 бумажные полоски, эффективность анализов повышается (Г. М. Ма- руашвили с соавт., 1966).
Методы исследования на шистосомозы . Исследование фекалий - порцию фекалий смешивают с 250 мл воды, процеживают через 3 слоя марли в конический сосуд, который доверху наполняют водой. Через 30 мин слой жидкости сливают, к осадку приливают свежую порцию воды. Осадок промывают до получения прозрачной надосадочной жидкости и микроскопируют.
Метод лярвоскопии - в колбу Эрленмейера с напаянной сбоку стеклянной трубочкой, направленной вверх, помещают 20-25 г фекалий и промывают водопроводной водой. Затем колбу накрывают темной бумагой, оставив на свету напаянную стеклянную трубочку при температуре +25...+30°С. Вылупившиеся мирацидии концентрируются у мениска в боковой трубочке, где их можно видеть с помощью лупы или невооруженным глазом. Исследование мочи -100 мл мочи, собранной в период между 10 ч утра и 14 ч дня, или суточную порцию отстаивают, а затем центрифугируют при 1500 об/мин. Полученный осадок наносят* на предметное стекло и микроскопируют. ВОЗ рекомендует метод фильтрования всей порции мочи. После фильтрования фильтры обрабатывают формалином или подогревают (чтобы убить яйца), а затем увлажняют водным раствором нингидрина. В подсушенных препаратах зародыши яиц приобретают фиолетовую окраску.
Применение иммунологических методов исследования для диагностики шистосомозов связано с трудностями, так как взрослые шистосомы и их яйца содержат большое количество антигенов, вызывающих иммунные реакции, которые не являются видоспецифическими (Д. Бредли, 1979).
В нашей стране для постановки иммунологических реакций при гельминтозах выпускается целый ряд стандартных диагностикумов. Практическое применение имеют аллергическая кожная проба на эхинококкоз и альвеококкоз, РЛА с эхинококковым антигеном, РСК на холоде, реакция преципитации на холоде в различных модификациях (кольцевая преципитация, преципитация в пробирках или капиллярах, которые ставятся с трихинеллезным, цистицеркозным и мигроаскаридозным антигенами). Стандартные диагностикумы для постановки вышеназванных серологических реакций изготавливаются предприятиями по производству бактерийных препаратов. К выпускаемым диагностикумам предприятие-изготовитель прилагает подробные инструкции о правилах хранения, сроках годности препарата и наставления по применению соответствующих антигенов с техникой постановки реакции.
В последние годы перечень серологических реакций, применяемых для диагностики гельминтозов, значительно расширился. В этих целях используются следующие реакции: РИГА, непрямой иммунофлюоресценции (РИФ), иммунодиффузии в геле (РИД), встречного иммуноэлектрофореза (ВИЭФ), РЭМА. Эти реакции могут использоваться при аскаридозе, токсокарозе, трихинеллёзе, анкилостомидозах, филяриатозах, эхинококкозе и альвеококкозе, опистор- хозе, шистосомозе, парагонимозе. Однако для этих реакции в нашей стране,не выпускаются стандартные диагностикумы и не регламентирована техника их постановки. Отдельные лаборатории, в основном научные, готовят самостоятельно специфические антигены и применяют их в различных модификациях. Описание этих методов широко представлено в литературе и не является строго унифицированным. Интерпретация данных иммунологического анализа должна основываться на изучении динамики иммунного ответа с учетом уровня специфичности и чувствительности каждой применяемой серологической реакции. Поэтому при постановке диагноза, а также при сероэпидемиологических обследованиях населения целесообразно пользоваться несколькими наиболее чувствительными реакциями. С этих позиций хорошо зарекомендовали себя реакции ВИЭФ и РЭМА, которые отличаются высокой чувствительностью и достаточно высокой специфичностью (П. Амбруаз-Тома, 1978; И. Е. Баллад, 1979; Г. М. Негряну, 1980; А. М. Пономарева, 1981; А. Я. Лысенко, 1978, и др.). Эффективность РЭМА проверена при амебиазе, лейшманиозе, трипаносомозе и токсоплазмозе (Г. А. Ермолин, 1980).