Гельминтологические методы. Лабораторная диагностика гельминтозов
Чаще всего заражение гельминтами происходит через зараженную пищу, воду, а также через немытые руки.
Прямые и косвенные методы диагностики гельминтозов
На сегодняшний день разработано множество методов диагностики гельминтозов, однако всех их можно разделить на две большие группы: прямые и косвенные. К прямым методам диагностики относятся те исследования, которые позволяют непосредственно выявить гельминты, их фрагменты, личинки или яйца. Косвенные методы диагностики гельминтозов основываются на выявлении вторичных изменений, характерных для той или иной разновидности гельминтоза.
Самыми популярными прямыми методами диагностики гельминтозов являются макро- и микрогельминтоскопические методы исследований.
Макрогельминтоскопические методы исследования
Вопросы читателей
18 October 2013, 17:25 Добрый день. Уже около почти год ощущаю зуд вокруг анального отверстия. Никаких болевых ощущений. Подскажите к кому обратится и что это может быть? Спасибо
Задать вопросМикрогельминтоскопические методы исследования
Иммунологические методы исследования
Диагностики гельминтозов основаны на обнаружении в сыворотке крови специфических антител к тем или иным гельминтам. Для иммунологического исследования применяется метод непрямой гемагглютинации, иммуноферментного анализа, иммуноэлектрофореза, иммуноабсорбции и другие серологические методы исследований крови.
Иммунологические методы исследования применяются для диагностики альвеококкоза, эхинококкоза, цистицеркоза, аскаридоза, шистосомоза и других гельминтозов.
Анализ желчи и дуоденального содержимого
Биопсия
Электропунктурная диагностика
Электропунктурная диагностика основана на анализе сопротивления кожи при раздражении ее слабым электрическим током. Электропунктурная диагностика при подозрении на гельминтоз может проводиться двумя способами: по методу Фолля или с помощью резонансного тестирования.
Инструментальные методы исследования
При гельминтозах также проводится ультразвуковое исследование, ФЭДГС, и компьютерная диагностика. Эти методы позволяют определить степень вреда, нанесенного гельминтами, а также определить состояние отдельных органов.
Прежде чем проводить лечебно-профилактические мероприятия при определенных гельминтозах сельскохозяйственных и промысловых животных, необходимо своевременно поставить точный диагноз болезни. Существуют две группы методов диагностики гельминтозов - прижизненные и посмертные. Кроме того, надо уметь дифференцировать гельминтозы и другие инвазионные, а также инфекционные заболевания.
Прижизненная диагностика гельминтозов
Диагноз на гельминтозы при жизни животных ставят на основании результатов лабораторных методов исследований и диагностических дегельминтизаций (прямых методов), а также иммунобиологических реакций (косвенных методов). Подсобную роль в диагностике гельминтозов играют данные исследований промежуточных хозяев (при биогельминтозах), клинические и эпизоотологические наблюдения. Основные методы диагностики - лабораторные исследования, позволяющие часто обнаруживать возбудителей гельминтозов или их яйца и личинки в экскретах (фекалиях, моче, мокроте), секретах (желчи), тканях (крови, мышцах), органах (кусочках кожи), в содержимом пунктатов и абсцессов.
Лабораторные методы диагностики гельминтозов животных легко выполнимы и достаточно точны, поэтому их широко применяют в производственных условиях (в ветеринарных лабораториях и в других ветеринарных учреждениях). В зависимости от целевого назначения лабораторные исслелования подразделяют на гельминтоовоскопические, гельминтоларвоскопические и гельминтоскопические методы исследований.
Гельминтоларвоскопические методы исследований используют для обнаружения личинок гельминтов (диктиокаул, мюллерий и др.). Из этой группы нередко применяют исследование фекалий по методам Бермана-Орлова и Вайда.
Гельминтоскопические или макрогельминтоскопические исследования применяют с диагностической целью для обнаружения выделяемых наружу гельминтов или их фрагментов (члеников нестод). В практических условиях этим способом устанавливают диагноз на аскаридоз свиней, дрепанидотениоз гусей и другие гельминтозы.
Из лабораторных методов диагностики гельминтозов животных большое практическое значение имеют: а) гельминтокопрологические исследования (исследование фекалий); б) исследование выделений других органов; в) исследование тканей.
Гельминтокопрологические исследования
Для этих же целей предложен специальный прибор, состоящий из стальных браншей, переходных ветвей и двух прикрепленных к ветвям полусферических поверхностей. Взятие фекалий из прямой кишки животных при помощи этого прибора облегчает труд ветеринарных работников и повышает производственную культуру этой манипуляции.
У кроликов фекалии в количестве нескольких шариков извлекают путем надавливания на брюшную стенку в области прямой кишки. Иногда допускается взятие проб фекалий с пола, если они свежие и известно, от какого животного. От одного животного берут не менее 10-20 г фекалий. От птиц, пушных зверей, собак, кошек и диких хищников (в зоопарках) фекалии собирают с чистого пола клеток (групповые пробы).
Все пробы фекалий этикетируют: по краю пакета или листа бумаги (где он не будет соприкасаться с экскрементами) простым карандашом пишут номер пробы (иногда и кличку коров). К пробам фекалий прилагают опись, в которой указывают наименование хозяйства, бригады, вид, пол и возраст животных (для взрослых - кличку или инвентарный номер) и дату взятия проб. В сопроводительной желательно указать цель исследований фекалий (например, для контроля проведенной дегельминтизации). Необходимо стараться быстрее доставить пробы фекалий в ветеринарную лабораторию и исследовать их без задержки, потому что при комнатной температуре через 16-20 часов из яиц кишечных стронгилят выходят личинки, что затрудняет диагностику диктиокаулеза и протостронгилидозов, а также других гельминтозов.
Если пробы фекалий в день взятия не исследуют, то их помещают в холодильник или подвал при температуре не выше 10°. Дезинфицирующие средства не приостанавливают развитие личинок внутри яиц гельминтов. Результаты исследования фекалий регистрируют в специальном журнале.
Оборудование для гельминтокопрологических исследований. Достоверность гельминтокопрологических исследований в значительной степени зависит от качества лабораторного оборудования. В 1968 г. на Украине разработан набор стандартного оборудования для массового исследования фекалий на гельмннтозы. Он состоит из предметов, изготовленных преимущественно из ударопрочного полистерола двух цветов, которые легко моются и обезвреживаются (выдерживают кипячение), а также удобны при транспортировке. В состав набора входят стаканчики различной емкости, воронки, конические пробирки, ситечки разных размеров, штатив с пятью планками (каждая на шесть воронок), кювет (по размерам штатива), коробки для хранения посуды, а также резиновые груши, стеклянные палочки и металлические петли (рис. 1).
В отличие от ранее применявшегося разнородного оборудования новый набор повышает эффективность лабораторных исследований фекалий и производительность труда ветеринарных работников, позволяет шире проводить количественные гельминтокопрологические исследования стандартизированными методами (контроль дегельминтизаций), а также улучшает эстетическую сторону этой работы.
Различают качественные и количественные методы исследований фекалий.
Качественные гельминтокопрологические исследования
Качественные методы исследований позволяют установить, какими гельминтами заражены животные.
Гельминтоовоскопические методы. Для прижизненной диагностики гельминтозов предложено большое количество методов гельминтоовоскопии, из которых рассмотрим только те, которыми чаще пользуются в ветеринарной практике.
Большинство гельминтокопрологических методов диагностики основано на разнице удельного веса яиц, личинок гельминтов или их фрагментов, с одной стороны, и жидкости, в которой взвешены исследуемые фекалии, - с другой. В зависимоти от соотношения удельного веса этих компонентов различают методы флотации, осаждения и комбинированные.
Методы флотации. При методах флотации (всплывания) используют жидкости (насыщенные растворы солей), удельный вес которых больше веса яиц гельминтов. В лабораторной практике наиболее широко применяют насыщенный раствор поваренной соли (удельный вес 1,18). Для приготовления такого раствора в кастрюлю с кипящей водой постепенно добавляют при помешивании хлорид натрия до образования на дне небольшого осадка (на 1 л воды берут около 400 г поваренной соли). Горячий раствор фильтруют в бутыль через несколько слоев марли или вату и применяют после остывания (на дне бутыли должен образоваться кристаллический осадок).
Реже в ветеринарных лабораториях используют насыщенные растворы сульфата магния с удельным весом 1,35 (920 г на 1 л горячей воды), гипосульфита натрия с удельным весом от 1,37 до 1,41, в зависимости от температуры окружающей среды (1750 г на 1 л горячей воды) и азотнокислого натрия с удельным весом 1,4 (соотношение селитры и горячей воды 1:1).
Метод Фюллеборна характеризуется простотой выполнения и высокой эффективностью при большинстве нематодозов и цестодозов животных, поэтому он занимает первое место среди других, гельминтокопрологических методов диагностики. В стеклянный, полистероловый или пластмассовый стаканчик емкостью 50-100 мл помещают 3-5 г фекалий и при помешивании стеклянной палочкой постепенно добавляют насыщенный раствор поваренной соли (хлорида натрия) из расчета на одну часть фекалий 15-20 частей флотационной жидкости. Плотные фекалии овец предварительно можно растереть с небольшим количеством раствора соли в фарфоровой ступке, после чего суспензию переливают в стаканчик, добавив необходимое количество раствора хлорида натрия. Всплывшие крупные частицы сразу удаляют палочкой, а взвесь фекалий целесообразно профильтровать в другой стаканчик через сито (иногда употребляют молочные ситечки). После отстаивания заряженной пробы в течение 45-60 минут металлической петлей снимают три капли поверхностной пленки, помещают их на предметное стекло и микроскопируют без покровного стекла. После каждой пробы петли промывают в стакане с водой (вместо рекомендуемых в некоторых руководствах прожиганий их на спиртовке).
Метод Калантарян - видоизмененный метод Фюллеборна. В качестве флотационной жидкости используют насыщенный раствор азотнокислого натрия. Время отстаивания взвеси 15-30 минут. Применяют для диагностики и акантоцефалезов.
Методы осаждения. При методах осаждения используют жидкости с меньшим удельным весом, чем удельный вес яиц.
Метод последовательного промывания. Небольшое количество фекалий (5 г) размешивают в стаканчике с 10-кратным количеством воды. Смесь фильтруют в большой стакан и доливают воду, после чего фильтрат отстаивают 5 минут. Затем сливают или отсасывают спринцовкой верхний слой жидкости до осадка; к осадку добавляют такое же количество воды, перемешивают и отстаивают снова 5 минут. Эти манипуляции повторяют до просветления верхнего слоя жидкости в стакане. Жидкость последний раз сливают, а осадок наносят на стекло или в бактериологическую чашку и исследуют под микроскопом. Этот метод часто применяют для диагностики большинства трематодозов и акантоцефалезов.
Метод Горшкова основан на принципе осаждения с последующей концентрацией яиц гельминтов. 150-300 г фекалий лошади помещают на металлическое сито или марлю в большую стеклянную воронку диаметром в верхней части 15-20 см. На нижний конец воронки надевают резиновую трубку длиной 10-15 см с зажимом на конце. Фекалии разрыхляют и заливают доверху теплой водой. Фекалии в воронке выдерживают от 4 часов до одних суток, после чего зажим осторожно открывают, часть жидкости выпускают в центрифужные пробирки и центрифугируют 3 минуты. Затем жидкость сливают, а осадок исследуют под микроскопом. Этим методом диагностируют драшейоз и габронематоз лошадей.
Комбинированные методы. Основаны на принципе осаждения и флотации яиц гельминтов, поэтому более эффективны в сравнении с предыдущими методами исследований. Ввиду сложности эти методы имеют сравнительно ограниченное применение в производственных условиях.
Метод Дарлинга. Небольшое количество фекалий (3-5 г) размешивают в стаканчике с 20-30 мл воды, смесь процеживают в центрифужные пробирки и центрифугируют 1-2 минуты, после чего верхний слой жидкости сливают, а к осадку доливают смесь равных частей глицерина и поваренной соли. Смесь в пробирках взбалтывают и вторично центрифугируют. Всплывшие на поверхность яйца снимают вместе с пленкой взвеси проволочной петлей, стряхивают на предметное стекло и микроскопируют. При отсутствии глицерина фекалии можно смешивать перед вторичным центрифугированием с насыщенным раствором поваренной соли.
Метод Щербовича. Техника исследования фекалий напоминает предыдущий метод. Отличается от него тем, что перед вторичным центрифугированием к осадку добавляют насыщенный раствор гипосульфита натрия (при макраканторинхозе свиней) или сернокислой магнезии (). По сравнению с методом Дарлинга этот метод более эффективен.
Флотационно-седиментационный метод Демидова рекомендуют для диагностики фасциолеза, а также других трематодозов жвачных. Пробу фекалий (3 г от овец и 5 г от крупного рогатого скота) помещают в стакан емкостью 200 мл и наливают в него доверху насыщенный раствор поваренной соли и тщательно размешивают стеклянной палочкой, после чего взвесь отстаивают 15-20 минут. Всплывшие на поверхность грубые частицы удаляют бумажным совочком, а надосадочную жидкость отсасывают спринцовкой (при исследовании большого количества проб жидкость можно сливать), оставляя на дне 20-30 мл осадка. К осадку доливают воду до полного объема стакана и тщательно размешивают. Смесь фильтруют в обычный стакан через марлю или металлическое сито и отстаивают 5 минут. Надосадочную жидкость отсасывают, оставляя на дне 15-20 мл осадка, который переносят в конический стаканчик, пропаласкивают обычный стакан и выливают смыв в маленький. Взвесь отстаивают в коническом стаканчике 3-5 минут, а жидкость в последующем отсасывают (эту процедуру повторяют). Просветленный осадок переносят на предметное стекло и микроскопируют. Этот метод эффективнее метода последовательного промывания.
Гельминтоларвоскопические методы. Метод Бермана-Орлова. Для исследования фекалий используют аппарат, состоящий из средней воронки (пластмассовой, полистероловой или стеклянной), резиновой трубки (10-15 см длиной), соединенной верхним концом с воронкой, зажима, укрепленного на нижнем конце резиновой трубки, металлического сита или куска марли и штатива (для одного или нескольких аппаратов). Смонтированный аппарат заполняют теплой водой (35-38°). 10-15 г свежих фекалий кладут на сито или завертывают в марлю и осторожно опускают в воронку. Фекалии от овец выдерживают в аппарате 2-4 часа, а от телят - не менее 6-7 часов. Затем зажим на трубке ослабляют, а вытекающую жидкость собирают в пробирку и центрифугируют в течение 2-3 минут. После этого верхний слой жидкости сливают быстрым опрокидыванием пробирки, а оставшуюся на дне жидкость переносят на предметное стекло и исследуют под микроскопом. Применение зажимов на резиновую трубку в аппарате Бермана связано с неудобствами, поэтому во многих ветеринарных лабораториях нижние концы резиновых трубок непосредственно соединяют с маленькими пробирками. Перед исследованием осадка под микроскопом жидкость не центрифугируют.
Фекалии жвачных можно исследовать на легочные нематодозы (особенно в экспедиционных условиях) упрощенным методом гельминтоларвоскопии (без использования воронок). Для этой цели применяют небольшие полуконические стаканчики (50 мл). Пробы фекалий помещают на ситечки или завертывают в марлю и опускают в стаканчики с водой. Через несколько часов фекалии удаляют, жидкость из стаканчика отсасывают или сливают, а осадок микроскопируют.
Метод Вайда. Несколько шариков фекалий от мелких жвачных помещают в бактериологическую чашку или на часовое стекло и овлажняют их небольшим количеством теплой воды. Через 10-20 минут фекалии удаляют, а оставшуюся жидкость исследуют под малым увеличением микроскопа. Эффективность этого метода значительно ниже в сравнении с предыдущим методом, поэтому его реже применяют для диагностики диктиокаулеза и протостронгилидозов овец.
Метод дифференциальной диагностики стронгилятозов по инвазионным личинкам. Возбудители большинства кишечных стронгилятозов имеют почти одинаковое строение яиц, поэтому при гельминтоовоскопии можно поставить только групповой диагноз (например, стронгилятозы).
Для установления более точного диагноза (родового) в ветлабораториях иногда получают культуру инвазионных личинок стронгилят. Около 5 г фекалий помещают в бактериологическую чашку, закрывают крышкой и ставят ее в термостат при температуре 25-30° на одну неделю. Затем фекалии с личинками исследуют по методу Бермана-Орлова (для выделения инвазионных личинок из фекалий).
Инвазионные личинки разных родов кишечных стронгилят отличаются по величине тела, строению хвостового конца чехлика и по количеству кишечных клеток. Например, личинки эзофагостом более крупные (до 1 мм длины), нитевидный хвостовой конец чехлика длинный, а кишечник имеет 20-32 клетки; личинки гемонхов средней длины (около 0,8 мм), с нитевидным хвостовым концом чехлика, кишечник имеет 16 клеток.
Периодическое промывание и отстаивание фекалий повторяют до просветления верхнего слоя. Верхний слой жидкости последний раз сливают, а осадок малыми порциями просматривают в кюветках с черным и белым дном. Обнаруженных гельминтов собирают при помощи пинцетов, препаровальных игл и кисточек, просматривают под микроскопом, после чего переносят в консервирующую жидкость. Чтобы выявить мелких нематод, осадок дополнительно исследуют по частям при помощи бинокулярной или штативной лупы с 10-20-кратным увеличением.
Количественные гельминтокопрологические исследования
Стандартизированный метод Фюллеборна менее точен в сравнении с методом Столла, но в виду простоты выполнения его широко применяют в ветеринарной практике для контроля эффективности дегельминтизаций животных. По технике выполнения стандартизированный метод напоминает другие методы качественных гельминтоовоскопических исследований. Однако у него имеется ряд особенностей, основными из которых являются следующие: 1) навески фекалий должны быть равными; 2) посуда одного обьема; 3) время отстаивания водных взвесей фекалий одно и то же; 4) петли одинакового диаметра, исследование равного количества капель.
Для ориентировочного учета интенсивности диктиокаулезной и прогостронгилидозной инвазии у жвачных можно применить стандартизированный метод Бермана-Орлова. Достоверность результатов повышается при увеличение количества и кратности исследований.
Исследование выделений других органов
Исследование содержимого конъюнктивальных полостей применяют для диагностики телязиоза крупного рогатого скота (возбудитель - Thelazia rhodesi). Из спринцовки орошают конъюнктивальные полости водным раствором йода; вытекающую жидкость собирают в кюветку или почковидный тазик и осматривают на наличие телязий. В данном случае водный раствор йода оказывает и лечебное действие.
Исследование истечений из клоаки проводят для прижизненной диагностики . Вытекающую слизь помещают на предметное стекло и исследуют под микроскопом с целью обнаружений яиц возбудителя болезни.
Исследование соскоба с перианальных складок - основной метод диагностики . Лопатковидной палочкой или спичкой, смоченной смесью равных частей глицерина и воды, делают соскоб с перианальных складок промежности и внутренней поверхности корня хвоста. Соскоб переносят на предметное стекло в каплю глицерина с водой, накрывают покровным стеклом и микроскопируют. Обнаружение яиц оксиур подтверждает клинический диагноз.
Исследование соскобов кожи из «летних язв» рекомендуется для диагностики кожной формы драшейоза и габронематоза. Соскоб берут со свежеизъязвленной поверхности кожи и помещают в каплю разведенной соляной кислоты (1:1000). Затем препарат расщепляют препаровальными иглами, накрывают покровным стеклом и исследуют под микроскопом для обнаружения личинок драшей или габронем.
Исследование тканей
Исследование кожи крупного рогатого скота (по Гнединой) применяют для диагностики онхоцеркоза. На нижней брюшной стенке у животного после подготовки операционного поля вырезают небольшой кусочек кожи толщиной 2 мм (с небольшое овсяное зерно), а ранку смазывают настойкой йода. В ветеринарной лаборатории этот кусочек кожи помещают на предметное стекло в физиологический раствор, расщепляют препаровальными иголками, а затем все сливают в центрифужную пробирку и ставят ее на несколько часов в термостат при температуре 37-38°. Затем волокна кожи удаляют, жидкость центрифугируют, а осадок микроскопируют с целью обнаружения подвижных микроонхоцерков.
Исследование кусочков мышц на часто проводят посмертно. Иногда для прижизненной диагностики трихинеллеза используют метод биопсии. Путем оперативного вмешательства вырезают кусочек мышцы (например, из наружных мышц уха), из которых готовят мелкие срезы (с овсяное зерно). Последние помещают на нижнее стекло компрессория, покрывают верхним стеклом и сближают их винтами до полного расплющивания. Просматривают срезы под трихинеллоскопом, малым увеличением микроскопа, с помощью проекционного трихинеллоскопа или проекционной камеры КТ-3.
Диагностические дегельминтизации
Для диагностической дегельминтизации отбирают несколько животных, изолируют от остального поголовья и задают им антгельминтик в терапевтической дозе. Выделенные в течение одних-двух суток фекалии от этих животных собирают и подвергают гельминтоскопическому исследованию на предмет обнаружения возбудителя болезни. В производственных условиях диагностические дегельминтизации нередко проводят для прижизненной диагностики мониезиоза жвачных, дрепанидотениоза гусей, цестодозов плотоядных, аскаридоза свиней и аскаридиоза кур.
Иммунологические реакции
Аллергические кожные реакции предложены для прижизненной диагностики фасциолеза овец, описторхоза плотоядных, и , мониезиоза овец, гемонхоза и диктиокаулеза овец, онхоцеркоза крупного рогатого скота и лошадей и трихинеллеза свиней.
Из серологических методов следует указать на реакцию сколексопреципитации, позволяющую диагностировать ранние стадии эхинококкоза и реакцию преципитации с использованием живых личинок аскарид и трихинелл для выявления соответствующих гельминтозов.
Исследование промежуточных хозяев гельминтов
Результаты гельминтологического обследования животных всегда должны дополняться данными исследований на гельминтозы промежуточных хозяев. Они позволяют выяснять гельминтологическую ситуацию, прогнозировать появление гельминтозов. Промежуточными хозяевами гельминтов могут быть моллюски (пресноводные и сухопутные), ракообразные (циклопы, дафнии, бокоплавы, водяные ослики), дождевые черви, насекомые (мухи, мошки, мокрецы, стрекозы, муравьи, жуки), почвенные клеши.
Эпизоотологическое значение имеет плотность (количественный состав) отдельных видов промежуточных хозяев. Чем она выше, тем больше имеется возможностей для заряжения животных гельминтозями. Наземные промежуточные хозяева находятся в разных местах (в навозных кучах, на выгулах, пастбищных участках и др.). Водные промежуточные хозяева в огромном количестве обитают у берегов стоячих мелких водоемов, в зарослях растений. В этих местах животные (особенно ) часто заражаются гельминтозами.
Промежуточных хозяев на наличие личинок гельминтов надо исследовать в свежем (лучше живом) состоянии под бинокулярной лупой или малым увеличением микроскопа. Личиночные стадии гельминтов в теле промежуточных хозяев находятся на разных стадиях развития, но наиболее заметными являются инвазионные личинки. В итоге исследований определяется экстенсивность (процент) и интенсивность (количество) инвазированности промежуточных хозяев личинками определенных видов гельминтов.
Орибатидные или панцирные, клещи (до 1 мм длины). Обитают в верхних слоях почвы. Это промежуточные хозяева мониезий жвачных и других гельминтов. Для обнаружения личинок ленточных червей (цистицерроидов) предварительно в капле воды на предметном стекле (под контролем лупы) расщепляют на части панцирь орибатидного клеща, затем препарат покрывают покровным стеклом и микроскопируют. Цистицеркоиды мониезий округлой формы (0,15-0,19 мм в диаметре), снабжены четырьмя присосками и хвостовым придатком. Они очень нежные, поэтому не следует применять метод компрессорного исследования клещей.
Дождевые черви других родов (Criodrilus, Eophila) обитают в водоемах с топкими, илистыми берегами. Они зарегистрированы в качестве промежуточных хозяев возбудителей гистрихоза и порроцекоза уток. Личинка гистрихиса очень крупная (до 3 см длины), беловатого цвета, просвечивает сквозь кожные покровы червя в виде волнистой полосы. Личинки порроцекумов в десять раз меньше предыдущей личинки (2,5-3 мм); они обнаруживаются в кровеносных сосудах при компрессорном исследовании дождевых червей под микроскопом.
Исследование бокоплавов. Бокоплавы достигают длины до 2 см, обитают в морских и пресноводных водоемах. Зарегистрированы они в качестве промежуточных хозяев возбудителей полиморфоза. стрептокароза и тетрамероза птиц. Личинок обнаруживают при компрессорном исследовании этих рачков. Личинки (акантеллы) полиморфуса овальной формы, оранжевого цвета, до 1 мм длины, заметны макроскопически.
Исследование водяных осликов. Водяные ослики от 1 до 1,5 см длины, живут в пресноводных водоемах, являются промежуточными хозяевами возбудителя филиколлеза птиц. При компрессорном исследовании можно выявить личинку (акантеллу) белого цвета, овальной формы, 0,7 мм длины.
Можно также исследовать и других промежуточных хозяев (мошек, мокрецов, мух, стрекоз, жуков, муравьев).
Люминесцентная микроскопия
Метод люминесцентной микроскопии (по В. Г. Эврановой) - новый метод диагностики гельминтозов. Он позволяет дифференцировать однотипные яйца разных видов гельминтов, а также отличать жизнеспособные яйца и личинки от мертвых. Предварительно яйца трематод, цестод и нематод обрабатывают растворами акридина оранжевого и другими флуорохромами. Жизнеспособные яйна и личинки нематод не люминесцируют или слабо люминесцируют, в то время как мертвые ярко светятся и окрашены в оранжевый, желто-зеленый или желтый цвет.
При люминесцентной микроскопии можно дифференцировать яйца главнейших цестод плотоядных, яйца возбудителей и гетеракидоза кур, имеющих, как известно, сходное строение по величине, форме и окраске, а также различать жизнеспособные и мертвые ооцисты кокцидий.
Препараты просматривают под микроскопом МУФ-3 или МЛ-2. Методика люминесцентной микроскопии сравнительно проста и может быть использована в производственных условиях (ветеринарных лабораториях).
Из других исследований, имеющих подсобное значение в установлении диагноза на гельминтозы. можно указать на такие, как выяснение морфологического состава крови (учет эозинофилии), метод определения фракции белков.
Краткая характеристика яиц гельминтов
Яйца представителей разных классов различаются по величине, цвету, форме, строению оболочек и внутреннего содержимого.
Яйца трематод. Чаще овальной формы с крышечкой на одном полюсе. Оболочка гладкая. У некоторых видов оболочка снабжена филаментами (отростками), бугорками. Окраска яиц от светло-серой до коричневой (чаще желтая).
Яйца цестод. Бывают двух типов: лентецов и цепней. У лентенов они напоминают яйца трематод (овальные с крышечкой). Яйца цепней резко отличаются по строению от яиц гельминтов других классов: они чаще средней величины, округлой формы, серого цвета, зрелые (внутри зародыш - онкосфера с тремя парами эмбриональных крючьев).
Яйца нематод. Отличаются от яиц трематод отсутствием крышечки; от яиц цестод - отсутствием онкосферы.
Размеры, форма, строение и цвет оболочек яиц нематод очень разнообразны. Наружная оболочка бывает гладкой, бугристой, ячеистой: толщина оболочек варьирует от тонкой (у стронгилят) до толстой (у трихоцефал). У большинства нематод яйца овальной формы, симметричные, у некоторых - получилиндрические (у драшей). Большинство нематод выделяют наружу незрелые яйца на предсегментационной стадии или нескольких шаров дробления, меньшинство - зрелые (внутри яйца сформирована личинка).
Яйца скребней. Они имеют овальную, эллипсоидную и веретенообразную формы: размер их от среднего до крупного. Выделяемые во внешнюю среду яйца содержат внутри личинку - акантор с десятью эмбриональными крючьями (зрелые).
Клинические наблюдения
Эпизоотологические данные
При диагностике многих гельминтозов сельскохозяйственных животных значительную помощь оказывают эпизоотологические данные (неблагополучие хозяйства по конкретным болезням, сезон года, возраст больных животных, характер пастбищ и водоисточников, метеорологические условия и др.). Например, массовое заболевание с признаками брюшных водянок и падеж овец осенью после дождливого лета и использование под выпасы заболоченных участков пастбищ дает основание заподозрить острую форму фасциолеза. Заболевание гусят летом с признаками расстройства пищеварения (поносы) и нервной системы (парезы) после выпаса их на мелком стоячем водоеме, обильно заселенном циклопами, является основанием для установления предполо-жительного диагноза на дрепанидотениоз. Падеж ягнят весной (через 3-4 недели после начала пастбищного содержания) должен вызвать подозрение о заболевании молодняка овец мониезиозом. Необходимо также учитывать зональные особенности гельминтозов домашних животных, желательно в комплексе с клиническими наблюдениями.
Простые методы
Макроскопический метод. При осмотре фекалий можно обнаружить гельминтов, их головки, членики, обрывки стробилы, выделяющиеся самостоятельно или после дегельминтизации. Этот метод особенно рекомендуется для выявления энтеробиоза, тениоза и тениаринхоза.
Небольшие порции кала перемешивают с водой в плоской ванночке или в чашке Петри и, просматривая при хорошем освещении на темном фоне, при необходимости пользуясь лупой, извлекают гельминтов и все подозрительные образования белого цвета пинцетом или пипеткой. Собранное переносят в другую чашку с водой или на предметное стекло в каплю разведенного глицерина или изотонического раствора хлорида натрия для дальнейшего изучения.
При методе отстаивания всю исследуемую порцию фекалий следует размешать с водой в стеклянном цилиндре, затем осторожно слить верхний слой воды. Так повторяют несколько раз. Когда жидкость станет прозрачной, ее сливают, а осадок просматривают небольшими порциями в стеклянной ванночке или чашке Петри, как было указано выше.
Микроскопические методы - основной способ исследования фекалий для обнаружения яиц или личинок гельминтов. Различные методы исследования описаны ниже. С целью повышения достоверности обследования анализы могут быть повторены несколько раз ежедневно или с промежутком в 1-3 дня.
Метод нативного мазка. Нативный мазок - наиболее распространенный и технически доступный метод исследования фекалий. В нативном мазке можно обнаружить яйца и личинки гельминтов всех видов. Однако при небольшом числе яиц в испражнениях их не всегда удается найти. Поэтому исследование кала только при помощи нативного мазка не является полноценным и должно дополняться методами обогащения. Эффективность исследования нативного мазка заметно повышается при просмотре четырех препаратов, приготовленных из пробы кала на двух предметных стеклах без покрытия покровными стеклами, что позволяет исследовать в общей сложности примерно такое же количество кала, как и по методу Като (см. ниже).
Небольшое количество (величиной со спичечную головку) размешанного кала тонко размазывают деревянной палочкой на поверхности предметного стекла в капле 50%-го раствора глицерина. Обычно на одном стекле готовят два мазка. Мазок просматривают под малым увеличением микроскопа (об. 8, ок. 7). В сомнительных случаях его накрывают покровным стеклом и исследуют под большим увеличением (об. 40).
Для приготовления большого нативного мазка 200-300 мг кала (размером с крупную горошину) растирают на стекле размером 6х9 см в 15-20 каплях 50%-го водного раствора глицерина. Просматривают под бинокулярным стереоскопическим микроскопом (об. 4, ок. 12,5 или об. 2, ок. 17) в проходящем свете без покровных стекол. В сомнительных случаях можно переводить объектив на большее увеличение. В таких мазках хорошо видны окрашенные крупные яйца гельминтов, несколько хуже - прозрачные яйца карликового цепня. Для обнаружения мелких яиц этот метод непригоден. Вместе с тем большой объем исследуемого материала и большое поле зрения при высокой глубине резкости обеспечивают значительную эффективность указанной модификации по сравнению с обычным нативным мазком.
Толстый мазок с целлофаном (метод Като) более эффективен, чем изучение нативного мазка, но также требует сочетания с методами обогащения. Выявляются яйца всех видов гельминтов, однако с целью обнаружения яиц карликового цепня (яйца прозрачные) или описторха (мелкие яйца) лаборант должен быть особо внимательным, чтобы их не пропустить (рис.21).
Метод основан на обнаружении яиц гельминтов в толстом мазке кала, просветленном глицерином и подкрашенном малахитовым зеленым. Предварительно гидрофильный целлофан нарезают пластинками размером 20 х 40 мм и погружают в смесь Като (6 мл 3%-го водного раствора малахитового зеленого, 500 мл глицерина, 500 мл 6%-го раствора фенола). 3-5 мл смеси хватает на 100 пластинок, которые готовы к использованию через сутки и могут храниться в этой же смеси в хорошо закрытой посуде при комнатной температуре в течение 6 мес. При отсутствии малахитового зеленого (рекомендуется для уменьшения утомляемости глаз лаборанта) и фенола (дезинфицирующее средство) можно пользоваться только 50%-м водным раствором глицерина, эффективность исследования не снижается.
Рис. 20. Методика приготовления толстого мазка кала с целлофаном по Като
100 мг испражнений наносят на предметное стекло, покрывают обработанной, как указано выше, пластинкой целлофана и придавливают резиновой пробкой так, чтобы испражнения не растекались из-под целлофана. Микроскопирование при малом или большом увеличении микроскопа проводят не позже, чем через 1 час (в жаркую погоду - 30-40 мин) после приготовления мазка. Причиной непрозрачности препарата могут быть толстый слой фекалий, плохая обработка пластинки в смеси Като, недостаточный срок выдержки препарата под целлофаном. Длительное просветление глицерином и чрезмерное высыхание препарата также затрудняют обнаружение яиц.
Метод закручивания по С.С. Шульману. Метод предложен для обнаружения в кале личинок гельминтов, в первую очередь стронгилоида. Исследуют только свежевыделенные фекалии, 2-3 г которых переносят в стеклянную банку, размешивают стеклянной палочкой круговыми движениями с 3-5-кратным количеством физиологического раствора, не касаясь стенок сосуда. Яйца и личинки гельминтов скапливаются в центре. После окончания перемешивания каплю на конце палочки быстро переносят на предметное стекло, закрывают ее покровным стеклом и исследуют под микроскопом.
Методы обогащения. Методы обогащения основаны на разности удельного веса яиц и применяемого солевого раствора, что позволяет обнаружить их небольшое количество. Если удельный вес яиц больше удельного веса жидкости, то яйца концентрируются в осадке, который исследуют под микроскопом. Этот метод седиментации (осаждения) применяют для яиц трематод. При большем удельном весе раствора яйца всплывают на поверхность жидкости, и тогда исследуют пленку. Это методы флотации (всплывания), они наиболее эффективны для обнаружения яиц анкилостомид, власоглава и карликового цепня.
Методы флотации. Метод Фюллеборна основан на всплывании яиц гельминтов в насыщенном растворе хлорида натрия, имеющем высокую относительную плотность (1,2), что дает возможность выявления яиц при небольшом их количестве. Метод более эффективен, чем изучение нативного мазка, хотя и сложнее. Достоинствами метода являются дешевизна и доступность. Рекомендуется сочетать изучение нативного мазка и метода Фюллеборна.
Насыщенный раствор готовят, растворяя 400 г хлорида натрия в 1 л воды при кипячении. Относительная плотность раствора 1,18-1,22. Раствор хранят в закрытой бутыли. Для проведения анализа в банку объемом 30-50 мл помещают 2-3 г испражнений и при помешивании палочкой доливают почти доверху насыщенный раствор хлорида натрия. Полоской бумаги быстро удаляют всплывшие крупные частицы. Через 45-60 мин. отстаивания проволочной петлей снимают поверхностную пленку и переносят ее на предметное стекло в каплю 50% водного раствора глицерина. Вместо снятия пленки петлей можно долить раствор в банке доверху, накрыть предметным стеклом, к поверхности которого пристают всплывшие яйца. Готовят несколько препаратов. Дополнительно просматривают 2-4 препарата из осадка, набирая его глазной пипеткой на 2 предметных стекла. Помимо поверхностной пленки, необходимо обязательно исследовать также и осадок, поскольку яйца трематод, тениид, неоплодотворенные яйца аскарид не всплывают в данном растворе. Яйца ряда гельминтов всплывают в соленом растворе не сразу. Так, если максимальное число яиц карликового цепня всплывает через 15-20 мин, то аскарид - через 1,5-2 ч, власоглава - через 2-3 ч.
Таким образом, к достоинствам этого метода относится его дешевизна и доступность, к недостаткам - необходимость просмотра препаратов на поверхностной пленки и осадка, а также длительность отстаивания.
Метод Е. В. Калантарян также является методом обогащения, но более эффективен и проще, чем метод Фюллеборна. Применяется насыщенный раствор нитрата натрия с относительной плотностью 1,38. Поэтому яйца большинства гельминтов всплывают и обнаруживаются в поверхностной пленке, исследование осадка не требуется.
Для приготовления насыщенного раствора нитрата натрия 1 кг соли нитрата натрия (натриевой селитры) растворяют в 1 л воды и кипятят до полного растворения и образования на поверхности пленки. Без фильтрования переливают в сухую бутыль. При отсутствии нитрата натрия его можно заменить нитратом аммония (аммиачная селитра), растворяя 1,7 кг на 1 л воды. Относительная плотность полученного раствора 1,3, что несколько снижает эффективность по сравнению с раствором нитрата натрия.
Достоинства метода: быстро всплывают и обнаруживаются в поверхностной пленке яйца большинства гельминтов, что исключает необходимость исследования осадка. Недостатками метода являются дефицит нитрата натрия, а также то, что яйца трематод, онкосферы тениид не всплывают и остаются в осадке. Необходимо учитывать, что при длительном (более 1 -2 ч) выдерживании фекалий в растворе яйца некоторых гельминтов начинают набухать и оседают, исчезая из поверхностной пленки.
Методы седиментации
Метод П. П. Горячева основан на принципе осаждения яиц. Мазок в этом случае получается светлый, без грубой примеси, что облегчает обнаружение мелких яиц трематод (описторха и др.). Удельный вес яиц описторха высок, поэтому они не всплывают в солевых растворах.
В цилиндр диаметром 2-3 см наливают 70-100 мл насыщенного раствора хлорида натрия. Отдельно тщательно размешивают 0,5 г испражнений в 20-25 мл воды и осторожно фильтруют через воронку с двумя слоями марли в цилиндр на солевой раствор, избегая перемешивания (так, чтобы образовалось два четко разграниченных слоя). Через 2-3 часа верхний слой с калом отсасывают пипеткой, а оставшийся солевой раствор оставляют стоять на 12-20 часов или центрифугируют. Осадок пипеткой переносят на предметное стекло, покрывают покровным стеклом и микроскопируют.
Метод Горячева был предложен для обнаружения яиц описторха и оказался эффективнее, чем исследование нативного мазка и метод Фюллеборна. В настоящее время для диагностики описторхоза (клонорхоза) рекомендуют методы Като и Калантарян, как достаточно эффективные и технически более простые.
Метод Красильникова. Под действием поверхностно-активных веществ, входящих в состав моющих средств (детергентов), яйца гельминтов освобождаются от испражнений и концентрируются в осадке.
Предварительно готовят 1%-й раствор стирального порошка «Лотос». Для этого 10 г порошка растворяют в 1 л водопроводной воды. При отсутствии «Лотоса» можно использовать и другие стиральные порошки, но каждого из них нужно брать столько, сколько растворится без образования осадка в 1 л водопроводной воды. В стеклянный сосуд емкостью 30-50 мл наливают 20-30 мл раствора детергента, туда же помещают небольшую порцию испражнений и хорошо перемешивают. Соотношение испражнений и раствора должно быть примерно 1:20. Испражнения должны находиться в растворе не менее суток. За это время на дне образуется осадок из 2-3-х слоев. Нижний слой состоит из грубых тяжелых частиц, в среднем слое собираются яйца гельминтов, верхний слой представляет собой беловато-серые хлопья. Затем пипеткой набирают 2-3 капли жидкости из среднего слоя и переносят на предметное стекло. На одном стекле готовят 2 препарата, накрывают покровным стеклом и микроскопируют.
Метод Красильникова позволяет обнаружить яйца всех видов гельминтов, выделяемые с испражнениями.
Эфир-формалиновый метод седиментации и химикоседиментационный метод при высокой эффективности весьма трудоемки, особенно при массовых обследованиях, в связи с этим целесообразнее использовать эфир-уксусный метод. Он позволяет после дополнительной обработки осадка химреактивами получить в нем практически только яйца гельминтов, что облегчает выявление мелких яиц трематод. Этот метод оказался универсальным, выявляющим яйца всех кишечных гельминтов, цисты кишечных простейших, он также может использоваться для количественной оценки интенсивности инвазии.
В центрифужные градуированные пробирки наливают 7 мл 10%-го раствора уксусной кислоты и добавляют 1 г фекалий до отметки 8 мл. Фекалий и тщательно перемешивают палочкой до образования однородной смеси, а затем процеживают через два слоя марли в другую центрифужную пробирку (чтобы в новой пробирке процеженного раствора снова было 8 мл, если меньше, то дополнительно можно ополоснуть 10% раствором уксусной кислоты воронку с бинтом, через которые процеживали раствор фекалий). В эту пробирку добавляют 2 мл эфира (до метки 10 мл), закрывают пробкой и энергично встряхивают в течение 30 сек. Смесь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 1 минуты (или 2 минуты при 1500 об/мин). Слой коагулянта (в виде пробки в верхней части пробирки) палочкой отделяют от стенок пробирки и вместе с надосадочной жидкостью осторожно сливают. Осадок (как правило, небольшой, бесцветный) наносят на предметные стекла пипеткой, накрывают покровным стеклом и микроскопируют.
7.7. Методы определения жизнеспособности яиц и личинок гельминтов
Жизнеспособность яиц гельминтов определяют по внешнему виду, путем окрашивания витальными красками, культивированием в оптимальных условиях и постановкой биологической пробы.
7.7.1. Определение жизнеспособности яиц или личинок гельминтов по внешнему видуЯйца гельминтов микроскопируют вначале при малом, затем при большом увеличении. У деформированных и мертвых яиц гельминтов оболочка разорвана или прогнута внутрь, плазма мутная, разрыхлена. У сегментированных яиц шары дробления (бластомеры) неравного размера, неправильной формы, часто сдвинуты к одному полюсу. Иногда встречаются аномальные яйца, которые, имея внешние уродства, развиваются нормально. У живых личинок аскарид мелкая зернистость имеется только в средней части тела, по мере их гибели она распространяется по всему телу, появляются крупные блестящие гиалиновые вакуоли, так называемые "нитки жемчуга".
Для определения жизнеспособности зрелых яиц аскарид, власоглавов, остриц следует вызывать активные движения личинок легким подогреванием препарата (до температуры не выше 37 °С). Жизнеспособность личинок аскарид и власоглавов удобнее наблюдать после их выделения из скорлупы яйца надавливанием на покровное стекло препарата препаровальной иглой или пинцетом.
У инвазионных личинок аскарид часто замечается чехлик, отслоившийся на головном конце, а у закончивших развитие в яйце личинок власоглавов на этом месте при большом увеличении обнаруживается стилет. У погибших личинок гельминтов независимо от их места нахождения (в яйце или вне его) замечают распад тела. При этом внутренняя структура личинки становится глыбчатой или зернистой, а тело мутным и непрозрачным. В теле обнаруживаются вакуоли, а на кутикуле - разрывы.
Жизнеспособность онкосфер тениид (бычьего, свиного цепней и др.) определяют по движению зародышей при воздействии на них пищеварительных ферментов. Яйца помещают на часовое стекло с желудочным соком собаки или искусственным дуоденальным соком. Состав последнего: панкреатина - 0,5 г, натрия бикарбоната - 0,09 г, дистиллированной воды - 5 мл. Часовые стекла с яйцами ставят в термостат при 36 - 38 °С на 4 часа. При этом живые зародыши освобождаются от оболочек. Оболочки живых онкосфер также растворяются в подкисленном пепсине и в щелочном растворе трипсина через 6 - 8 часов в термостате при 38 °С.
Если поместить яйца тениид в 1%-ный раствор натрия сульфида или 20%-ный раствор натрия гипохлорида, или же в 1%-ный раствор хлорной воды при 36 - 38 °С, зрелые и живые зародыши освобождаются от оболочек и не изменяются в течение 1 суток. Незрелые и мертвые онкосферы сморщиваются или набухают и резко увеличиваются, а затем "растворяются" в течение 10 минут - 2 часов. Живые зародыши тениид также активно двигаются в смеси 1%-ного раствора натрия хлорида, 0,5%-ного раствора натрия гидрокарбоната и желчи при 36 - 38 °С.
Жизнеспособность адолескариев фасциол, собранных на растениях и других объектах водоемов, проверяют исследованием их на предметном стекле в физиологическом растворе под микроскопом с нагревательным столиком. При подогревании личинки трематоды, находящиеся в цисте, начинают двигаться.
Для определения жизнеспособности яиц карликового цепня наиболее проста методика Иониной Н.С.: у живых яиц медианная пара эмбриональных крючьев или параллельна латеральным, или последние образуют с медианной угол у основания меньше 45°. У мертвых яиц латеральные пары образуют у основания угол с медианной парой больше 45° или же крючья беспорядочно разбросаны (утрачивается их парное расположение); иногда наблюдается сморщивание зародыша, образование зернистости. Более точен метод, основанный на появлении движений онкосферы при резкой смене температур: от 5 - 10° до 38 - 40 °С.
Определение жизнеспособности незрелых яиц нематод следует изучать во влажной камере (чашках Петри), помещая яйца аскарид в 3%-ный раствор формалина, приготовленный на изотоническом растворе натрия хлорида при температуре 24 - 30 °С, яйца власоглавов в 3%-ном растворе соляной кислоты при температуре 30 - 35 °С; яйца остриц в изотоническом растворе натрия хлорида при температуре 37 °С. Чашки Петри следует открывать 1 - 2 раза в неделю для лучшей аэрации и снова увлажнять фильтровальную бумагу чистой водой.
Наблюдения за развитием яиц гельминтов ведут не реже 2 раз в неделю. Отсутствие признаков развития в течение 2 - 3 месяцев свидетельствует о их нежизнеспособности. Признаками развития яиц гельминтов являются сначала стадии дробления, деление содержимого яйца на отдельные бластомеры. В течение первых дней развивается до 16 бластомер, которые переходят во вторую стадию - морулу и т.д.
Яйца анкилостомид культивируют в стеклянном цилиндре (высотой 50 см и диаметром 7 см), закрытом пробкой. Смесь из равных объемов стерильного песка, древесного угля и испражнений с яйцами анкилостомид, разведенную водой до полужидкой консистенции, наливают осторожно на дно цилиндра при помощи стеклянной трубки. В течение 1 - 2-суточного отстаивания в темноте при температуре 25 - 30 °С из яиц вылупляются рабдитовидные личинки, а через 5 - 7 суток они становятся уже филяриевидными: личинки выползают вверх по стенкам цилиндра, где видны даже невооруженным глазом.
Яйца трематод, естественно развивающиеся в воде, например описторхисов, дифиллоботриид, фасциол и других, помещают на часовое стекло, чашку Петри или в другой сосуд, наливают небольшой слой обычной воды. При культивировании яиц фасциол следует учесть, что они развиваются быстрее в темноте, при этом в живых яйцах при температуре 22 - 24 °С через 9 - 12 суток формируется мирацидий. При микроскопировании развивающихся яиц трематод хорошо заметны движения мирацидия. Мирацидий фасциолы из оболочек яйца выходит только на свету.
Метод Фюллеборна. Личинки анкилостомид и стронгилид культивируют на агаре в чашке Петри с животным углем. После выдерживания в термостате при температуре 25 - 30 °С в течение 5 - 6 часов личинки расползаются по агару, оставляя за собой дорожку из бактерий.
Метод Харада и Мори. В пробирки, помещенные в штатив, добавляют 7 мл дистиллированной воды. Деревянной палочкой берут 0,5 г испражнений и делают мазок на фильтровальной бумаге (15 х 150 мм) в 5 см от левого края (эту операцию проводят на листе бумаги, чтобы защитить поверхность лабораторного стола). Затем полоску с мазком вставляют в пробирку так, чтобы свободный от мазка левый конец достигал дна пробирки. Накрывают верхний конец куском целлофана и плотно обхватывают резинкой. На пробирке пишут номер, фамилию обследуемого. В таком состоянии пробирки хранят 8 - 10 суток при температуре 28 °С. Для изучения личинок снимают и удаляют целлофановую крышку и извлекают пинцетом полоску фильтровальной бумаги. При этом следует проявлять осторожность, так как небольшое количество инвазионных личинок может передвигаться к верхнему концу фильтровальной бумаги или к стенке пробирки и проникать под поверхность целлофана.
Пробирки помещают в горячую водяную баню при температуре 50 °С на 15 минут, после чего содержимое их встряхивают и быстро переливают в 15-миллилитровую пробирку для осаждения личинок. После центрифугирования надосадочную жидкость удаляют, а осадок переносят на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и микроскопируют под малым увеличением.
Для дифференциального диагноза филяриевидных личинок необходимо пользоваться данными таблицы 3.
Таблица 3
ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА ФИЛЯРИЕВИДНЫХ ЛИЧИНОК A. DUODENALE, N. AMERICANUS, S. STERCORALIS, trICHOStrONGYLUS SP.
| Личинки | Размеры | Характерные признаки |
| A. duodenale | Длина тела около 660 мкм, чехлика - 720 нм | Исчерченность чехлика менее выражена, ротовой выступ менее заметен, передний конец тела (но не чехлика) тупой, диаметр кишечной трубки меньше, чем бульбус пищевода, хвостовой конец тупой |
| N. americanus | Длина тела около 590 мкм, чехлика - 660 нм | Чехлик заметно исчерчен, особенно в хвостовой части тела, ротовой выступ кажется темным, передний конец тела (но не чехлика) закруглен подобно узкому концу куриного яйца, передняя часть кишечной трубки такого диаметра, как бульбус пищевода, хвостовой конец резко заострен |
| S. stercoralis | Длина тела около 500 мкм | Личинка без чехлика, пищевод составляет около половины длины тела, хвост тупой или разветвленный |
| Trichostrongylus sp. | Длина тела около 750 мкм | Просвет кишечника не прямой, а зигзагообразный, хвостовой конец закруглен и имеет форму кнопки |
Мертвые ткани в большинстве случаев воспринимают краски быстрее, чем живые. Эти особенности используют в гельминтологии для определения жизнеспособности яиц и личинок гельминтов. Однако в отдельных случаях некоторые краски лучше воспринимаются живыми тканями, чем мертвыми.
Для дифференциального определения живых и мертвых яиц и личинок применяют следующие краски и способы.
Для окраски живых и мертвых тканей часто используют лейкобазу метиленового синего. Живая клетка или ткань редуцирует метиленовый синий в бесцветную лейкобазу, мертвая ткань не обладает такой способностью, поэтому приобретает окраску.
Критерием состояния яйца является окрашивание зародыша, но не оболочки. Такая его способность связана с условиями гибели яйца. В тех случаях, когда волокнистая оболочка в мертвом яйце не теряет свойств полупроницаемости, она не будет пропускать красители, следовательно, мертвый зародыш не будет окрашиваться. Окрашенный зародыш всегда свидетельствует о гибели яйца.
Для окраски яиц аскарид можно использовать метиленовый синий в растворе молочной кислоты с едкой щелочью (метиленового синего 0,05 г, едкого натра 0,5 г, молочной кислоты - 15 мл). Живые яйца окраску не воспринимают; окрашиваются в синий цвет зародыши мертвых яиц. Окрашивание личинок аскарид основным раствором краски бриллианткрезилового синего в концентрации 1:10000 осуществляют следующим образом: на предметное стекло наносят каплю жидкости с яйцами аскарид и каплю основного раствора краски. Препарат накрывают покровным стеклом, которое плотно прижимают к предметному стеклу при легком постукивании препаровальной иглой. Под микроскопом наблюдают количество вышедших личинок и степень их окрашиваемости; после чего этот же препарат просматривают повторно через 2 - 3 часа. Живыми считаются только недеформированные личинки, не окрасившиеся в течение 2 часов. Мертвые личинки или не выходят из яиц, или окрашиваются при разрыве скорлупы (частично или полностью).
При определении жизнеспособности яиц аскаридий птиц возможна окраска препаратов 5%-ным спиртовым раствором йода. При его нанесении на препарат зародыши мертвых яиц аскаридий в течение 1 - 3 сек. окрашиваются в оранжевый цвет.
Мертвые яйца описторхисов и онкосферы бычьего цепня окрашиваются раствором толуидинового синего (1:1000), а мертвые онкосферы бычьего цепня - раствором бриллианткрезилового синего (1:10000). При этом приобретают цвет зародыши и оболочки как мертвых, так и живых яиц. Поэтому после окраски яйца и онкосферы отмывают в чистой воде и дополнительно окрашивают их сафранином (в разведении 1:10000 спирта 10 °С). Спирт удаляет краску с оболочек, а сафранин окрашивает в красный цвет. В результате живые яйца окрашиваются в красный цвет; яйца с мертвыми зародышами - в синий, а оболочка остается красной. Мертвые зародыши онкосфер бычьего цепня быстро, в течение нескольких минут, окрашиваются в ярко-красный или розовый цвет сафранином или в синий цвет бриллианткрезиловым синим в разведении 1:4000, или индигокармином в разведении 1:1000 - 1:2000. Живые зародыши не изменяются под влиянием этих красок даже спустя 2 - 7 часов.
Для определения жизнеспособности яиц карликового цепня рекомендуется использовать следующие краски:
1. Бриллианткреазиловый синий (1:8000) - через 1 час у мертвых яиц особенно ярко окрашивается онкосфера, которая резко выделяется на бледном или бесцветном фоне остальной части яйца.
2. Сафранин (1:8000 при воздействии в течение 2 часов и 1:5000 - в течение 3 - 5 часов).
3. 50%-ный раствор пирогалловой кислоты в разведении 1:2 - при воздействии в течение 1 часа при температуре 29 - 30 °С (чем ниже температура, тем продолжительнее процесс окрашивания).
7.7.3. Люминесцентный метод исследования яиц и личинок гельминтовЛюминесцентная микроскопия дает возможность дифференцировать живые и мертвые объекты без повреждения яйца. Для флюоресценции используются не ультрафиолетовые лучи, а сине-фиолетовая часть видимого света, с обычным микроскопом и предметными стеклами; к осветителю ОИ-18 добавляют специальный набор цветных фильтров.
Живые и мертвые яйца аскарид, остриц, карликовых цепней, бычьего цепня, широкого лентеца и других гельминтов люминесцируют неодинаково. Это явление наблюдается как при первичной люминесценции без применения красителей, так и при окраске флюорохромами (акридиновый оранжевый, корифосфин, примулин, ауролин, сульфат берлерина, трипафлавин, риванол, акрихин и др.).
Неокрашенные, живые несегментированные яйца аскарид светятся ярко-зеленым светом с желтоватым оттенком; у мертвых яиц оболочка излучает зеленый свет значительно ярче, чем темно-зеленая зародышевая часть; у яиц аскарид с личинкой проявляется только оболочка, а у мертвых - и оболочка, и личинка ярко-желтого цвета.
Непигментированные и несегментированные живые яйца остриц и карликовых цепней излучают зеленовато-желтый свет, у мертвых яиц интенсивно люминесцирует оболочка на фоне темно-зеленой зародышевой массы.
При вторичной люминесценции (при окраске акридин оранжевым в разведении 1:10000 и 1:50000 от 30 минут до 2 часов) оболочка живых и мертвых нематод, трематод и цестод люминесцирует неодинаково.
Скорлупа живых и мертвых яиц аскарид, токсокар, остриц, карликовых цепней, крысиных цепней, бычьего цепня, лентецов окрашивается в оранжево-красный цвет. Зародыши живых яиц аскарид, токсаскарисов, крысиного цепня, широкого лентеца и онкосферы бычьего цепня люминесцируют тусклым темно-зеленым или серо-зеленым цветом. Мертвые зародыши яиц этих гельминтов излучают "горящий" оранжево-красный цвет. Живые личинки остриц и токсокар (освобожденные от скорлупы яйца) излучают тусклый серо-зеленый свет, при их гибели цвет изменяется от головного конца в "горящий" светло-зеленый, затем желтый, оранжевый и, наконец, в ярко-оранжевый.
При окраске флюорохромами - корифосфилом, примулином у мертвых яиц аскарид и власоглавов наблюдается свечение от лилово-желтого до медно-красного цвета. Жизнеспособные яйца не люминесцируют, а окрашиваются в темно-зеленый цвет.
Живые яйца трематод (парагонимусов и клонорхисов) не люминесцируют после окраски акридиновым оранжевым, а от мертвых яиц исходит желтовато-зеленый цвет.
Метод люминесценции может быть применен и для определения жизнеспособности личинок гельминтов. Так, флюорохромированные раствором акридинового оранжевого (1:2000) личинки стронгилят, рабдитат светятся: живые - зеленым (с оттенком), мертвые - ярко-оранжевым светом.
Живые мирацидии, вышедшие из оболочки, излучают тусклый голубоватый свет с еле заметным светло-желтым венчиком ресничек, но спустя 10 - 15 минут после гибели проявляются ярким "горящим" светло-зеленым, а затем - оранжево-красным светом.
7.7.4. Метод биологической пробыНапример, для определения жизнеспособности яиц аскаридат (аскариды свиные, человека, токсокары, токсаскарис и др.) на одно животное (морские свинки, мыши) необходимо не менее 100 - 300 яиц с развившейся личинкой. Яйца аскаридат в изотоническом растворе натрия хлорида вводят пипеткой через рот мыши или морской свинки. Через 6 - 7 суток животное забивают, вскрывают и исследуют его печень и легкие в отдельности на наличие личинок аскаридат. Для этого печень и легкие измельчают ножницами на мелкие кусочки и исследуют их по методу Бермана или Супряги (раздел 6.1.2).
Если животных заражали живыми инвазионными яйцами, то при вскрытии в печени и легких обнаруживают мигрирующие личинки аскаридат.
В случае заражения яйца фасциол в фекалиях лабораторных животных можно обнаружить у кроликов через 2 месяца, у морских свинок - через 50 суток, у мышей - через 35 - 40 суток.
Для более быстрого получения ответа лабораторных животных вскрывают через 20 - 30 суток и исследуют печень на наличие молодых фасциол.
Для определения жизнеспособности яиц карликового цепня также рекомендуется их скармливание незараженным ими ранее белым мышам с последующим вскрытием животных через 92 - 96 часов и выявлением цистицеркоидов в кишечных ворсинках или цестод в просвете кишечника.
Для определения жизнеспособности яиц описторхисов рекомендуется метод (Герман С.М., Бэер С.А., 1984), основанный на физико-химической активации железы вылупления мирацидия и стимуляции двигательной активности личинки, что приводит к открыванию крышечки яйца и активному выходу мирацидия в экспериментальных условиях.
Взвесь яиц описторхисов в воде предварительно охлаждают до 10 - 12 °С (все последующие операции осуществляют при комнатной температуре 19 - 20 °С). В центрифужную пробирку вносят 1 каплю взвеси, содержащую 100 - 150 яиц. Пробирку ставят в штатив на 5 - 10 минут. За это время все яйца успевают опуститься на дно. Затем полоской фильтровальной бумагой осторожно отсасывают излишек воды и в пробирку добавляют 2 капли специальной среды. Среду готовят на 0,005 М Трис-HCl буфере; в буфер добавляют 12 - 13%-ный раствор этанола и краситель (фуксин, сафранин, эозин, метиленовый синий и т.д.). Пробирку встряхивают, ее содержимое переносят пипеткой на предметное стекло и оставляют на 10 минут, слегка покачивая. Затем добавляют 2 капли указанной среды. Препарат готов для микроскопирования под обычным световым микроскопом при 20-кратном увеличении.
За это время у жизнеспособных личинок открывается крышечка, и мирацидий активно выходит в указанную среду. Благодаря наличию в ней этанола, они через 2 - 5 минут обездвиживаются и затем окрашиваются с помощью красителя. Их легко можно обнаружить и посчитать при микроскопировании.
Отбор проб и их консервирование
Для исследования берут фекалии из разных мест порциями в количестве 50 г и в чистой стеклянной или пластмассовой посуде с плотной крышкой направляют в лабораторию. Исследованию подвергаются свежие фекалии (не более суточной давности), а в некоторых случаях (при исследовании на стронгилоидоз) сразу после дефекации. Предложен ряд консервантов фекалий, содержащих яйца гельминтов: 4-10% раствор формалина, который для предупреждения развития яиц анкилостомид необходимо подогреть до t° 50-60°; смесь 0,2% водного раствора азотнокислого натрия (1900 мл), раствора Люголя (5 г йода, 10 г йодистого калия, 250 мл воды), формалина (300 мл) и глицерина (25 мл), в к-рой яйца гельминтов сохраняются 6-8 мес.; смесь глицерина (5 мл), формалина (5 мл) и воды (100 мл); растворы 1-1,5% детергентов «Лотос», «Экстра», «Барф», «Тайд» и т. д. (в весовом соотношении фекалий и раствора детергента 1: 5); смесь мертиолата 1: 1000 (200 мл), формалина (25 мл), глицерина (5 мл), дистиллированной воды (250 мл) с добавлением 0,6 мл раствора Люголя (из расчета 1 г фекалий на 10 мл смеси).
Для диагностики гельминтозов применяются макро- и микрогельминтоскопические методы исследования фекалий.
Макрогельминтоскопические исследования
Метод отстаивания
Суточную порцию фекалий тщательно перемешивают с 5-10-кратным количеством воды, сливают в высокие стеклянные цилиндры (банки, ведра) и оставляют до полного осаждения взвешенных частиц. Верхний мутный слой осторожно сливают и доливают чистую воду доверху (повторяют несколько раз, пока вода над осадком не станет прозрачной). Слив верхний слой, переносят осадок в кювету или чашку Петри и просматривают его (на темном фоне) под лупой или невооруженным глазом.
Метод отсеивания
Перемешанные с водой фекалии помещают на верхнее сито прибора, состоящего из системы сит с отверстиями убывающего диаметра, прибор соединяют с водопроводной сетью и, открыв водопроводный кран, промывают, а вытекающую жидкость отводят в канализацию. Крупные гельминты остаются на верхнем сите, а более мелкие задерживаются на нижних. Сита переворачивают и, смыв содержимое в темные кюветы, просматривают невооруженным глазом или под лупой.
Микрогельминтоскопические исследования
Проводят с целью обнаружения яиц (гельминтоовоскопические методы - цветн. рис. 1) или личинок гельминтов (гельминтоларвоскопические методы).
Гельминтоовоскопические методы
Качественные методы без обогащения
Нативный мазок . Небольшое количество фекалий растирают на предметном стекле в капле 50% раствора глицерина или кипяченой воды. Крупные частицы осторожно удаляют, смесь покрывают покровным стеклом и исследуют под микроскопом (просматривают два мазка). Удобнее и проще готовить длинные мазки между двумя предметными стеклами. Нативный мазок применяют только в дополнение к методам обогащения, т. к. он недостаточно эффективен, особенно при слабых инвазиях.
Толстый мазок с целлофаном по Като (К. Kato, 1954) является весьма эффективным методом исследования. Кусочки гидрофильного целлофана (размером 4x2 см) замачивают на 24 часа в смеси глицерина (50 мл), 6% раствора фенола (500 мл) и 3% водного раствора (6 мл) зеленой малахитовой (последняя не обязательна). Ок. 100 мг фекалий размазывают на предметном стекле и, покрыв кусочком влажного целлофана, придавливают резиновой пробкой № 5. Препарат исследуют через 30-60 мин., когда он слегка подсохнет и просветлится, вследствие чего яйца гельминтов легко обнаружить под малым увеличением микроскопа.
Качественные методы с обогащением (методы всплывания и осаждения)
Первые основаны на применении насыщенных растворов различных хим. веществ, в которых яйца всплывают благодаря разнице удельного веса.
Метод Кофоида-Барбера (Ch.А. Kofoid, М. A. Barber) в модификации Фюллеборна (F. Fulleborn, 1920). Ок. 5 г фекалий в высокой и узкой баночке (объемом 100 мл) размешивают деревянной палочкой в 100 мл насыщенного раствора поваренной соли, уд. вес к-рого 1,18 (400 г соли растворяют при кипячении в 1 л воды). Всплывшие на поверхность крупные частицы быстро удаляют палочкой или кусочком бумаги. После отстаивания смеси в течение 45-90 мин. проволочной петлей (диам. 0,8-1 см) снимают всю поверхностную пленку, переносят ее на предметное стекло. При исследовании на яйца анкилостомид смесь отстаивают 10-15 мин. Можно снимать пленку непосредственно предметным стеклом, к-рым покрывают баночку так, чтобы оно соприкасалось с жидкостью (насыщенный раствор соли доливают до краев баночки). После отстаивания предметное стекло снимают, быстро переворачивают и исследуют под микроскопом (без покровного стекла) приставшую к нему пленку с яйцами гельминтов. Этот метод хорошо выявляет яйца всех нематод и карликового цепня. Тяжелые яйца трематод; большинства цестод и неоплодотворенных аскарид всплывают плохо, поэтому исследуют и осадок. Для этого после снятия пленки жидкость из баночки быстро сливают и из осадка петлей или пипеткой берут несколько капель, переносят их на предметное стекло, добавляют каплю глицерина для просветления и исследуют под микроскопом.
Метод Е. В. Калантарян (1938) Является более эффективной модификацией метода Фюллеборна. В нем раствор поваренной соли заменен насыщенным раствором азотнокислого натрия, уд. вес к-рого 1,39 (один объем азотнокислого натрия растворяют в равном объеме воды при кипячении), пленку снимают через 20-30 мин.
Применяются также методы Фауста (Е. С. Faust, 1939), Брудастова с соавт. (1970) и др.
Для осаждения яиц гельминтов используют хим. вещества, растворяющие жиры и белки фекалий.
Метод Телеманна (W. Telemann, 1908) в модификации Миягавы (Y. Miyagawa, 1913) . Ок. 5 г фекалий растирают в ступке или баночке, добавив по 5 мл этилового эфира и 50% раствора соляной к-ты; смесь процеживают через проволочное или волосяное сито в пробирку и центрифугируют. В пробирке образуется 3 слоя: вверху - эфир с растворенным жиром, ниже - соляная к-та с растворенными белковыми веществами, в осадке - нерастворимые части фекалий и яйца гельминтов. Верхние слои сливают, а к осадку добавляют воду и центрифугируют. Несколько капель осадка переносят на предметное стекло и исследуют под микроскопом. Этим методом можно обнаружить яйца всех видов гельминтов, но они иногда деформируются.
Метод Ритчи (L. S. Kitchie, 1948). Для растворения жиров и белков используют формалин и эфир.
Для осаждения яиц гельминтов можно применять различные детергенты. За рубежом получил распространение метод фильтрации в специальных аппаратах Белла, который применяется для исследований не только фекалий, но и мочи, крови и т. д.
Существует ряд методов, сочетающих принципы флотации и осаждения яиц. К их числу относятся методы Лейна (С. A. Lane), Риваса (D. Rivas), Горкиной, Дарлинга (S. Т. Darling). Один из таких флотационно-седиментационных методов, а также метод последовательных сливов предложены Н. В. Демидовым (1963, 1965) для исследования на фасциолез и дикроцелиоз.
Количественные методы
Метод Столла (N. R. Stoll, 1926). В градуированную широкую пробирку или колбочку (с двумя метками: 56 и 60 мл) наливают до первой метки децинормальный раствор едкого натра, добавляют фекалии до тех пор, пока уровень жидкости не достигнет второй метки, тщательно перемешивают стеклянной палочкой и, поместив 10 стеклянных бусинок или мелких камешков, закрывают пробкой и встряхивают в течение 1 мин. Быстро, чтобы взвесь не отстоялась, набирают градуированной пипеткой 0,075 мл смеси (0,005 г фекалий), переносят на предметное стекло с нанесенной на нем сеткой, покрывают покровным стеклом и подсчитывают под микроскопом яйца гельминтов в препарате; умножив полученное число на 200, получают количество яиц в 1 г фекалий. Для более точного результата подсчитывают яйца в двух или более препаратах и берут средний показатель. Метод Столла нечувствителен при слабых инвазиях. Поэтому рекомендуют подсчитывать число яиц в препаратах, приготовленных различными методами флотации или осаждения, при условии постоянного использования равной навески фекалий и посуды одного объема. Используют также толстый мазок по Като.
Метод Бивера (Р. С. Beaver, 1950). Готовят стандартный мазок, густоту к-рого определяют при помощи электрофотометра, а затем подсчитывают в нем все яйца гельминтов.
Гельминтоларвоскопические методы
Метод Берманна (G. Baermann, 1917). 5-10 г свежевыделенных фекалий помещают на металлической сетке в стеклянную воронку, на узком конце к-рой надета резиновая трубка с зажимом. Во избежание загрязнения осадка частицами кала рекомендуется подкладывать (на сетку) бумагу или добавлять в фекалии животный уголь или кукурузную муку. Воронку наполняют теплой водой (t° 45-50°) до соприкосновения с фекалиями. В силу термотропности личинки активно перемещаются в теплую воду и постепенно скапливаются в нижней части воронки, над зажимом. Через 3-4 часа зажим открывают, жидкость спускают в 1-2 пробирки, центрифугируют в течение 2-3 мин., верхний слой сливают, а осадок исследуют на предметном стекле под микроскопом.
Метод выявления мирацидиев шистосом. Фекалии промывают в темноте при t° 8-10°, осадок выдерживают 45 мин. на ярком свете при t° 28°, затем переливают в темную колбу с трубочкой сбоку. Мирацидии концентрируются в прозрачной боковой трубке, откуда их можно выбрать.
Для выявления личинок анкилостом применяют также методы Фюллеборна и др.
Методы исследования других выделений, а также тканей и органов
Ок. 100 мл исследуемой мочи отстаивают 30 мин. в цилиндре и, удалив верхний слой, сливают 10- 15 мл осадка в пробирку, центрифугируют при 1500 об I мин в течение 1-2 мин.; осадок исследуют. Желательно собирать всю суточную порцию мочи.
Моче-половой шистосоматоз диагностируют путем выявления мирацидиев. Порцию свежей мочи центрифугируют в течение 5 мин., осадок переливают в окрашенную в черный цвет колбу, к верхней части к-рой припаяна прозрачная стеклянная трубочка. Добавляют воду в соотношении 1:5, 1: 10 и ставят на 2 часа в термостат при t° 25-30°. Вышедшие из яиц мирацидии видны через прозрачную трубочку невооруженным глазом в виде быстро движущихся точек. При хрон, форме шистосоматоза у больных к концу мочеиспускания выделяется кровь, но яйца в моче находят редко, поэтому рекомендуется прибегать к биопсии мочевого пузыря.
Исследование мокроты. В мокроте могут находиться яйца парагонимусов, шистосом, томинксов, личинки мигрирующих нематод, фрагменты эхинококкового пузыря. Всю доставленную порцию мокроты тщательно просматривают невооруженным глазом или под лупой, выбирают и исследуют все видимые обрывки тканей, скопления ржавого цвета и пр.; затем просматривают всю порцию мазками. Гнойную мокроту заливают равным количеством 0,5% раствора едкой щелочи, центрифугируют и исследуют осадок.
При некоторых гельминтозах в мокроте наблюдаются характерные изменения. При парагонимозе, напр., в мокроте можно обнаружить скопления яиц в виде желтоватых комочков, а также большое количество слизи, лейкоциты, эритроциты, альвеолярные клетки, спирали Куршманна, эластические волокна, кристаллы Шарко-Лейдена. Выявлены также характерные ромбовидные кристаллы с заостренными концами. Наличие большого числа эозинофилов позволяет дифференцировать парагонимоз от туберкулеза.
Исследование содержимого абсцессов и пунктатов . В гнойных выделениях абсцессов, а также в опухолях и кистах, удаленных при оперативном вмешательстве, можно обнаружить гельминтов, их фрагменты, личинки и яйца (эхинококк, альвеококк, спарганум, цистицерк, дирофилярия, аскариды, токсокара, парагонимус и др.). Техника исследования обычная; в некоторых случаях из тканей опухоли готовят гистологические срезы. Гнойное содержимое можно обработать методом Телеманна; прозрачную жидкость исследуют также, как и дуоденальное содержимое, добавляя серный эфир. Эхинококковую жидкость центрифугируют и исследуют осадок на наличие сколексов и крючьев; препараты окрашивают карболфуксином по Цилю-Нельсену.
Исследование крови. В крови обнаруживают микрофилярий и личинок мигрирующих нематод. Каплю крови берут из пальца или из мочки уха и исследуют в свежем виде или готовят из нее препараты.
Каплю крови помещают на предметное стекло с нанесенным квадратом из вазелина и слегка прижимают покровным стеклом. Под микроскопом видны микрофилярии, двигающиеся между клетками крови. Кровь можно помещать между двумя слоями клейкой целлюлозной ленты; микрофилярии сохраняют подвижность в течение 6 час.; в полностью высохшем препарате их можно различить под микроскопом в течение 30 дней. Идентифицировать виды микрофилярий можно лишь в окрашенных мазках или толстых каплях. Приготовленные препараты высушивают, гемолизируют и окрашивают по Романовскому - Гимзе, Райту, Цилю-Нельсену, Лейшману, Папаниколау (см. Райта метод окраски, Романовского-Гимзы метод, Циля-Нельсена метод). Обнаружив микрофилярий в капле крови, окрашенной по Романовскому-Гимзе, препарат дополнительно окрашивают гематоксилином Хансена; через 15-60 мин. промывают 2 мин. в проточной воде. Перекрашенный препарат дифференцируют в 0,2% растворе соляной к-ты; чехлик микрофилярий окрашивается в бледнофиолетовый цвет, а ядерная субстанция тела - в темно-фиолетовый.
При слабых инвазиях необходимо исследовать 2-10 лед крови с анти-коагулянтом (напр., с 5% раствором лимоннокислого натрия) одним из следующих методов.
Метод Кнотта (J. Knott, 1939), модифицированный Маркеллом и Фоге (Е. К. Markell, М. Voge, 1965). 2 мл крови перемешивают в центрифужной пробирке с 10 дел 1% уксусной к-ты, центрифугируют в течение 2 мин. при 1500 об/мин; поверхностный слой сливают, осадок распределяют на нескольких предметных стеклах и исследуют под микроскопом. Препараты можно окрашивать по Романовскому-Гимзе или другими методами.
Метод фильтрации Белла (D. R. Bell, 1967). В аппарате, состоящем из воронки из нержавеющей стали с прямоугольным отверстием и мембранных фильтров той же формы, размером 19 х 42 мм, с величиной пор от 0,8 до 5 мкм, фильтруют в пробирки кровь, гемолизированную в смеси из 1 мл детергента типола и 9 мл физиол, раствора (для ускорения фильтрации аппарат соединен с вакуумным насосом). Фильтр фиксируют в кипящей дистиллированной воде и окрашивают по Романовскому-Гимзе или горячим гематоксилином Эрлиха. Окрашенный фильтр высушивают в эксикаторе или в изопропиловом спирте (последовательно в 3 чашках), просветляют на стекле иммерсионным маслом и исследуют под покровным стеклом. Окрашенные препараты сохраняются несколько недель. Метод Белла наиболее эффективен для количественного учета микрофилярий в крови.
Применяется также метод с поливидоном Голдсмида.
Исследование кожи. В коже можно обнаружить микрофилярий онхо-церков и личинок гельминтов животных, вызывающих кожную форму larva migrans (см.). Срезы кожи или материал, полученный скарификацией, берут в области бедра, икры, ягодицы или на уровне дельтовидной мышцы. Конусообразный кусочек эпидермиса поднимают энтомологической булавкой и, срезав бритвой, исследуют на стекле в капле физиол, раствора. При отрицательном результате свежий препарат повторно просматривают через 10 мин.; личинки обычно локализуются по краям препарата. Полученный материал можно выдерживать в 2 мл физиол, раствора в течение 1-2 час. и исследовать осадок. Рекомендуют брать у больного 5 срезов кожи.
Можно готовить препараты и из крови и тканевой жидкости, выделившихся после сильного сжатия срезов. Капли окрашивают по Майеру, Романовскому-Гимзе или гематоксилином Делафильда.
Стандартный метод количественного учета инвазии. Биопсированный участок кожи диам. 3-5 мм и весом не менее 1-4 мг взвесить, разрезать на мелкие кусочки и подсчитать личинки под микроскопом в физиол. растворе на предметном стекле; 1-4 личинки в поле зрения обозначают знаком +, 5-9 личинок - знаком ++ , 10-19 - знаком +++, 20 и более - знаком + + + +. Количественный учет удобнее проводить на окрашенных препаратах.
Исследование на трихинеллез, цистицеркоз и Шистосоматозы
Выявление личинок трихинелл
Компрессионный метод. Кусочек двуглавой или икроножной мышцы (вблизи сухожилия), взятой хирургическим путем с соблюдением асептики, расщепляют препаровальными иглами на отдельные тонкие волоконца, сдавливают их между двумя предметными стеклами в капле глицерина так, чтобы препарат был тонким и прозрачным. Под микроскопом с затемненным полем зрения хорошо видны личинки трихинелл. Эффективно исследование нескольких кусочков мышц в компрессориумах, используемых в вет.-сан. практике, особенно в специальных трихинеллоскопах.
Метод переваривания Бечмена (G. W. Bachman, 1928). 1 а измельченных мышц заливают 60 мл искусственного желудочного сока (0,5 г пепсина; 0,7 мл концентрированной соляной к-ты; 100 мл воды) и выдерживают 18 час. в термостате при t° 37°; верхний слой жидкости сливают, к осадку добавляют теплой воды (t° 37-45°) и выливают в аппарат Берманна. Через час жид-, кость спускают в пробирку, центрифугируют и исследуют осадок. Если личинки заключены в обызвествленные капсулы, их предварительно декальцинируют в растворе соляной, азотной, или серной к-ты.
Биопроба . Кусочки исследуемых мышц скармливают белым мышам или крысам. Через 2-3 дня можно обнаружить половозрелых трихинелл в дуоденальном содержимом, а через 2-3 нед.- личинок в мышцах диафрагмы и языка.
Гистологические срезы. Кусочки мышц фиксируют в жидкости Буэна, Ценкера или др.; обычным способом готовят срезы на микротоме и окрашивают их гематоксилином Делафильда.
Выявление цистицерков
Кусочек экстирпированной мышцы, соединительной ткани и пр. осматривают невооруженным глазом, осторожно выделяют цистицерк - беловатый полупрозрачный пузырек размером 1-2 см, раздавливают его между двумя предметными стеклами в капле глицерина и исследуют под микроскопом. Для определения жизнеспособности выделенных из тканей цистицерков их выдерживают в 50% растворе желчи на физиол. растворе в термостате при t° 37°; через 10-60 мин. головка жизнеспособного цистицерка выворачивается наружу. Обызвествленных цистицерков предварительно декальцинируют 4% раствором азотной к-ты в течение часа.
Выявление яиц шистосом
При хрон, формах шистосоматозов, когда образование гранулем препятствует выходу яиц из тканей в просвет кишечника или в мочевыводящие пути, применяют биопсию слизистой оболочки прямой кишки, к-рую производят специальной ложкой при помощи ректоскопа, выбирая участок с видимым поражением. Биопсированный кусочек раздавливают между двумя предметными стеклами и исследуют под микроскопом. При отрицательном результате кусочки просветляют в 4% растворе едкой щелочи и готовят из них гистол. срезы. Биопсию слизистой оболочки тощей кишки производят перорально и полученный материал исследуют комперссионным методом или готовят из него гистол, срезы. В ряде случаев моче-полового шистосоматоза диагноз может быть поставлен только на основании эндовезикальной биопсии. При гепатолиенальной форме шистосоматоза производят пункционную биопсию печени; из полученного материала готовят гистол, срезы и исследуют их под люминесцентным микроскопом. Люминесцентный микроскоп с темным полем использования и для исследования тканей печени на яйца шистосом. При поражении шистосомами женских половых путей выделения собирают при помощи влагалищного зеркала или берут острой ложечкой кусочки слизистой оболочки шейки матки; полученный материал исследуют под микроскопом на стекле в капле физиол, раствора.
Исследование на энтеробиоз и тениидозы
Перианальный соскоб (рекомендуется брать вечером, через 1 - 1,5 часа после того, как пациент лег спать, или утром до совершения туалета). Спичкой, срезанной наискось и смоченной в капле жидкости (физиол, раствор, кипяченая вода или 2% раствор двууглекислой соды), нанесенной на предметное стекло, осторожно делаю? соскоб со слизистой оболочки ануса и складок вокруг него (от центра кнаружи). Собранную на конце спички слизь счищают краем покровного стекла в каплю жидкости на предметном стекле и, покрыв этим же покровным стеклом, исследуют. При массовых обследованиях, когда соскобы берут в детских или других учреждениях, использованную спичку помещают в каплю жидкости на предметном стекле, после подсыхания капли покрывают другим предметным стеклом и доставляют в лабораторию, завернув в бумагу и закрепив резинкой. Для исследования ректальной слизи пользуются специальным прибором - трубочкой Шахматова или Циманна, с помощью которых берут слизь из прямой кишки и исследуют мазки под микроскопом.
Метод с ватным тампоном. Пациентам на дом выдают пробирку с ватным тампоном на стеклянной или деревянной палочке; утром пациент протирает перианальные складки тампоном, Смоченным кипяченой водой, и помещает его в пробирку с небольшим количеством воды. В лаборатории тампоны прополаскивают в той же пробирке с новой порцией воды и осадок исследуют после центрифугирования.
Целлофановый метод Холла (М. С. Hall, 1937). Квадратный кусочек целлофана укрепляют резинкой на стеклянной палочке. Соскоб делают сухим целлофаном и помещают его в пробирку. В лаборатории целлофан слегка сдвигают с палочки и, срезав его кончик ножницами, расправляют на предметном стекле; смочив децинормальным раствором едкого натра, покрывают покровным стеклом и исследуют под микроскопом.
Метод с целлюлозной лентой Грэма (С. F. Graham, 1941). Полоску целлюлозной ленты прижимают клейкой стороной к перианаль-ным складкам обследуемого, затем той же стороной к предметному стеклу и исследуют без покровного стекла; можно добавлять каплю толуена. В. В. Каледин (1972) для этих целей предложил применять целлулоидные диски, вырезанные из отмытой рентгеновской пленки и смоченные глицерином; диски исследуют на предметном стекле в капле силикатного клея. Методом с целлюлозной лентой можно исследовать также нательное белье детей.
Подногтевой соскоб. Края ногтя, ногтевое ложе, подногтевые пространства смачивают 0,5-1% раствором едкой щелочи и протирают влажными ватными тампончиками. Тампоны помещают в центрифужные пробирки с этим же раствором, центрифугируют и исследуют осадок.
Методы исследования объектов окружающей среды на яйца и личинки гельминтов (санитарно-гельминтологические исследования)
Исследования проводят с целью определения степени загрязненности яйцами и личинками гельминтов объектов внешней среды. Полученные данные используют для оценки сан. состояния учреждений и предприятий и эффективности проводимых мероприятий по борьбе с гельминтозами.
При изучении степени загрязненности различных объектов окружающей среды яйцами и личинками гельминтов и оценки их роли в эпидемиологии гельминтозов важно установить не только число найденных яиц, но и их жизнеспособность и инвазионность, которые определяют: а) по внешнему виду, под микроскопом; б) окрашиванием различными красителями, в т. ч. люминесцентными; как правило, живые яйца и личинки не окрашиваются; в) культивированием в оптимальных условиях до инвазионной стадии; г) заражением лабораторных животных (биопроба).
Исследования воды и канализационных стоков. Для одного исследования используют 10-25 л воды (рек, морей, прудов, купальных бассейнов, водопровода) и 1-2-5 л канализационных стоков.
Метод 3. Г. Васильковой (1941). Воду или канализационные стоки фильтруют через мембранные ультрафильтры в аппарате Гольдмана, состоящем из стеклянной или металлической воронки с фильтрами, соединенной при помощи кольца-насадки с колбой Бунзена. Для ускорения процесса фильтрации к аппарату подключают вакуумный насос. После фильтрации мембранные фильтры просматривают под микроскопом, просветлив их 50% раствором глицерина; скопившийся осадок счищают и просматривают отдельно в виде мазков. Применяются фильтровальные аппараты и других конструкций.
Метод Г. Ш. Гуджабидзе и Г. А. Юдина (1963) для исследования канализационной жидкости. 1 л жидкости отстаивают 2 часа в цилиндре Лисенко; полученный осадок (5-9 мл) обрабатывают, как при исследовании почвы (см. ниже).
Метод Н. А. Романенко (1967). К 1л сточной жидкости, помещенной в стеклянный цилиндр емкостью 1200-1500 мл, добавляют 0,4-0,6 г сернокислого алюминия или хлорного железа (с целью коагулирования, ускоряющего процесс осаждения взвешенных частиц) и через 40 мин. смесь центрифугируют 3 мин. при 1000 об/мин; верхний слой сливают, а для растворения хлопьев добавляют 1-2 мл 3% раствора соляной к-ты, затем 150 мл насыщенного раствора азотнокислого натрия. Осадок исследуют, как почву.
Исследование почвы
Загрязненность почвы яйцами гельминтов определяют с целью выявления очагов гельминтозов и оценки эффективности работы по их оздоровлению.
Метод 3. Г. Васильковой и В. А. Гефтер (1948). 12,5 г почвы смешивают в пробирках (объемом 100 мл) из нержавеющей стали или латуни с 20 мл 5% раствора едкой щелочи, добавив 10 стеклянных бусинок или мелких камешков. Пробирки закрывают резиновыми пробками и встряхивают в течение 20 мин. в аппарате для встряхивания или вручную. Вынув пробки, пробирки центрифугируют 3-5 мин., поверхностную жидкость сливают, к осадку добавляют 60-80 мл насыщенного раствора азотнокислого натрия и, тщательно перемешав, вновь центрифугируют 3-5 мин. В сю поверхностную пленку со всплывшими яйцами снимают, прикасаясь к поверхности смеси сложной петлей (5-6 петель, соединенных на общем стержне), и переносят в стаканчик с водой; перемешивают с тем же раствором, центрифугируют; всю процедуру повторяют не менее 3 раз. Содержимое стаканчика, куда переносят пленку, разбавляют водой и фильтруют через мембранные фильтры, которые исследуют под микроскопом в капле глицерина.
Метод 3. Г. Васильковой и В. А. Гефтер в модификации А. А. Намитокова (1961) отличается от основного метода тем, что вместо исследования препаратов пленки используют половину содержимого пробирки (каждый раз добавляя новую порцию насыщенного раствора азотнокислого натрия), фильтруют и исследуют фильтры.
Н. А. Романенко (1968) рекомендует исследовать на яйца гельминтов пробы почвы и осадка сточных вод с помощью аппарата, предложенного Г. Ш. Гуджабидзе. 50 г почвы тщательно перемешивают в течение 1 мин. в 150 мл воды в центрифужных пробирках (емкостью 250 мл) специальными лопастями, которые приводятся в действие электромотором. Смесь центрифугируют 3 мин. при 1000 об/мин, воду сливают и, добавив 150 мл насыщенного раствора азотнокислого натрия, перемешивают и снова центрифугируют 3 мин. Пробирки с пробами устанавливают в штатив, доливают раствор азотнокислого натрия до образования выпуклого мениска, покрывают предметными стеклами (10 х 6 см) и отстаивают 10-15 мин., затем стекла снимают и исследуют; процедуру повторяют не менее 4 раз.
Исследование на личинки гельминтов по методу Берманна (1917). 200-400 г почвы помещают в кусочке марли на металлическую сетку (с диам, отверстий 1-2 мм), надетую на широкую часть стеклянной воронки, укрепленной в штативе. На узкий конец воронки натянута резиновая трубка с зажимом. Воронку наполняют теплой (t° 50°) водой так, чтобы нижняя часть сетки с почвой соприкасалась с водой. В силу термотропности личинки активно выползают в теплую воду и, оседая, скапливаются в нижней части резиновой трубки над зажимом. Через 3-4 часа из воронки выпускают в пробирку 50 мл содержимого, центрифугируют и исследуют осадок.
Исследование овощей, фруктов и ягод
Исследуют преимущественно овощи, ягоды и фрукты, употребляемые в пищу без термической обработки. Метод 3. Г. Васильковой (1948). По 5-10 штук овощей или фруктов (ок. 0,5 кг) или 100- 200 г зелени (салат, зеленый лук) заливают на несколько часов водой в широкогорлых стеклянных банках с притертыми пробками и встряхивают 10-20 мин. в аппарате для встряхивания или вручную. Воду сливают, исследуемые объекты прополаскивают чистой водой и всю смывную воду фильтруют в аппарате Гольдмана; фильтры исследуют, просветлив глицерином. Можно подкрашивать фильтры 25% раствором Люголя в глицерине; при этом яйца гельминтов окрашиваются в коричневый цвет и их легко распознать среди крахмальных зерен, окрашенных в синий цвет. Большой осадок обрабатывают, как почву.
Исследование смывов с предметов обихода и с рук. Кисточкой для клея (или ватным тампоном, обернутым кусочком капроновой ткани), смоченной в 2% растворе двууглекислой соды, многократно проводят по обследуемому предмету или рукам, после чего ополаскивают в том же растворе, налитом в пробирку. В лаборатории кисточки и тампоны прополаскивают чистой водой; все смывные воды центрифугируют и исследуют осадок.
Метод В. А. Гефтер (1960). Пыль с мягкого инвентаря эффективнее собирать при помощи пылесоса, подключенного к воронке, к-рая состоит из 2 разъемных частей: на поверхность нижней части, покрытой металлической или пластмассовой сеткой, помещают мембранный фильтр и укрепляют его, надев верхнюю часть воронки. Собранную воронку присоединяют к шлангу пылесоса резиновой трубкой. Пыль с предмета собирают в течение 3 мин., после чего фильтр вынимают и заменяют новым. В лаборатории фильтры просматривают под микроскопом, просветлив их глицерином. Если слой пыли на фильтре велик, его соскабливают и просматривают в виде мазков или обрабатывают, как почву.
Иммунологические методы диагностики
Возможность использования иммунол. методов для диагностики гельминтозов обусловлена способностью гельминтов продуцировать активные антигены, воздействующие на иммунокомпетентные клетки хозяина и стимулирующие продукцию антител. Наиболее эффективны иммунодиагностические методы при кишечных гельминтозах, когда секреты и экскреты гельминтов, обладающие антигенной активностью, попадают непосредственно в кровь хозяина. Иммунол, реакции используют для диагностики аскаридоза, трихинеллеза, филяриатозов, шистосоматозов, эхинококкоза и альвеококкоза, цистицеркоза, парагонимоза, симптомокомплекса larva migrans- (токсокароз, ангиостронгилез) и др. Применяют различные серол, тесты (реакции преципитации, агглютинации, связывания комплемента, флюоресцирующих антител) и внутрикожные аллергические пробы. Антигены готовят из личинок и половозрелых гельминтов, используя солевые экстракты гомогенатов свежезамороженных или лиофилизированных тканей, а также разные биологически активные жидкости (жидкость из эхинококковых пузырей, полостную жидкость аскарид и др.). В связи с тем что гельминты обладают весьма сложной антигенной структурой и в их антигенной мозаике имеются компоненты и отдельные детерминанты, перекрестно реагирующие с другими видами гельминтов, бактериями, антигенами хозяина, разрабатываются методы очистки их от неспецифических компонентов. Фракционирование проводят разными методами: гель-фильтрацией в колонках с сефадексами, ионообменной хроматографией на ДЕАЕ-сефадексе, обработкой кислотами и др. Фракционные антигены обладают обычно более высокой специфичностью, чем цельные экстракты, активность же их приблизительно одинакова. Иммунодиагностические методы находят все большее применение. Реакции используют не только для наиболее полного и раннего выявления больных, но и для исследования очагов и изучения эпидемиологии гельминтозов.
Серологические реакции. Реакцию микропреципитации на живых личинках применяют для диагностики нематодозов - преимагинальной фазы аскаридоза, анкилостомидозов, трихинеллеза. Реакция становится положительной через 5- 10 дней после заражения (аскаридозом, анкилостомидозами) и сохраняется в течение 90-100 дней. Антигеном служат живые личинки нематод, выделенные из тканей экспериментально зараженных лабораторных животных. Выделенных личинок тщательно отмывают от белков хозяина стерильным физиол, раствором и дистиллированной водой и по 10-15 экз. помещают с помощью пастеровской пипетки на стерильное предметное стекло с луночкой. Наносят 2-3 капли испытуемой сыворотки, накрывают стерильным покровным стеклом, заключают во влажную камеру (чашка Петри, выстланная увлажненной фильтровальной бумагой) и выдерживают 24-48 час. в термостате при t° 37°. При положительной реакции под малым увеличением микроскопа видны вокруг ротового и анального отверстий личинок серовато-белые, слегка опалесцирующие массы преципитатов шаровидной или зигзагообразной формы. Эффективность реакции достигает 85-95% .
Реакция кольцепреципитации разработана В. П. Пашуком (1957) для диагностики трихинеллеза. Реакция становится положительной на 2--3-й неделе болезни. Эффективность ее достигает 80-90% . Антигеном служит экстракт порошка из высушенных при t° 35° личинок, выделенных из мышц зараженных животных. В пробирки диам. 0,5 см наливают по 0,1 мл каждого разведения антигена и осторожно наслаивают на него (или опускают на дно) равное количество испытуемой сыворотки так, чтобы жидкости не смешивались. Пробирки выдерживают 30 мин. в термостате при t° 37°, а затем 30- 60 мин. при комнатной температуре. При положительной реакции на границе соприкосновения антигена и сыворотки появляется беловатое нежное кольцо, легко распадающееся при встряхивании.
Реакция преципитации в геле по Оухтерлоню (О. Ouchterlony, 1949) в микромодификации А. И. Гусева и В. С. Цветкова предложена И. А. Гиновкер, Е. А. Забозлаевой, А. В. Дорониным (1970) для диагностики ранней фазы описторхоза. По предварительным данным, ее эффективность 87%. Антигеном служит экстракт гомогената свежезамороженных половозрелых описторхисов, выделенных из печени кошек.
Реакция непрямой гемагглютинации (см.) с диагностикумом - взвесью формалинизированных и танизированных эритроцитов барана, сенсибилизированных эхинококковой жидкостью,- разработана
Л. Н. Степанковской (1972) для диагностики эхинококкоза и альвеококкоза.
РНГА с диагностикумом из формалинизированных эритроцитов барана, сенсибилизированных экстрактом гомогената свежезамороженных цистицерков свиного цепня, предложена Л. М. Коноваловой (1973) для диагностики цистицеркоза мозга; она эффективна в 85% случаев.
РНГА с аскаридным диагностикумом предложена для диагностики преимагинальной фазы аскаридоза.
Реакция связывания комплемента (см.) ставится по обычной методике и используется для диагностики трихинеллеза и цистицеркоза.
Метод люминесцирующих антител (непрямой метод). Этот метод с обезжиренным сухим гомогенатом цистицерков свиного цепня в качестве антигена, фиксированным на предметном стекле, разработан JI. М. Коноваловой (1973) для диагностики цистицеркоза человека. Та же реакция с гистол, срезами личинок трихинелл в качестве антигена разработана для диагностики трихинеллеза.
E. С. Лейкина, В. А. Гефтер.