Скл - смешанная культура лимфоцитов. Иммунодиагностика бесплодия методом скл
СКЛ (смешанная культура лимфоцитов) - это тест, позволяющий определить степень распознавания иммунными системами супругов антигенов тканевой совместимости друг друга.
Один из видов клеток крови, лимфоциты — являются основой иммунной системы. При этом среди клеток лейкоцитов существует некая иерархия, есть главные клетки, есть подчиненные, из которых каждая выполняет свою функцию.
При встрече лимфоцита с любыми чужеродными для организма объектами (клетками другого организма, вирусами, бактериями, и т. д.), то развивается иммунный ответ. Степень силы иммунного ответа будет зависеть от сходства структуры антигенов тканевой совместимости (HLA- антигенов).
Иммунный ответ выражается в появлении клонов-потомков одной клетки, при этом это клетки, строго специализированные к конкретным чужеродным факторам, на которые необходим ответ. Иначе говоря, реакция иммунных клеток на что-то выражается том, что они начинают делиться. Деление клеток можно оценить по скорости синтеза ДНК. Чем больше синтезируется ДНК — тем интенсивнее делятся клетки, тем их больше, тем активнее идет развитие иммунного ответа. Интенсивность образования ДНК можно выявить путем включения в культуру клеток радиоактивного нуклеотида одного из «кирпичиков» ДНК, тимидина. Именно так и производится оценка смешанной культуры лимфоцитов.
Технически это можно сделать так. У обоих супругов берут кровь, из которой выделяют лимфоциты, которые затем помещают в благоприятную для деления питательную среду. При смешении лимфоцитов разных людей, они начинают друг на друга реагировать. Однако если просто зарегистрировать активность образования ДНК в смешанной культуре разных людей, невозможно понять, как реагирует конкретный человек на другого конкретного человека, потому что "воевать" начинают клетки всех тех людей, лимфоциты которых помещены в среду.
Для того, чтобы оценить индивидуальную реакцию, клетки одного из супругов подвергают воздействию, которое делает невозможным их деление. Однако антигенные свойства лимфоцитов при этом сохраняются. В таком случае вся активность клеток в культуре будет связана только с живыми клетками другого супруга. Сравнивая различные комбинации культур живых и лишенных способности активно действовать клеток, можно получить необходимую информацию о степени иммунологического сходства супругов.
Анализ предполагает исследование 12-ти различных культур, оценка реакции в которых проводится на 3-и и 5-е сутки.
В результате получают 24 цифры, дающие информацию о реакции конкретной женщины на антигены тканевой совместимости мужа в процессе имплантации и во время беременности.
Не только иммунное отторжение, но и иммунная защита беременности - активный процесс. Для развития иммунологической толерантности на первом этапе важно правильное иммунологическое распознавание ДНК мужа, содержащихся в зародыше. Если это распознавание вялое, медленное, происходит слишком поздно, тогда зародыш атакуется естественными клетками-киллерами матери и погибает.
Анализ СКЛ позволяет не только оценить состояние иммунологического распознавания лимфоцитов супругов друг другом, но и проконтролировать процесс лечения с помощью иммунизации лимфоцитами, выбрать метод и дозу иммунизации, оценить перспективы применения того или иного способа исправления ситуации. Поэтому после иммунизации анализ на СКЛ приходится повторять.
СКЛ = смешанная культура лимфоцитов = MLC = mixed lymphocyte culture.Этот тест состоит из набора культур, которые определяют степень распознавания супругами антигенов тканевой совместимости друг друга.Лимфоцит - центральная клетка иммунной системы.Что такое СКЛ?И. И. Гузов, к. м. н., гл. врач Центра иммунологии и репродукции СКЛ = смешанная культура лимфоцитов = MLC = mixed lymphocyte culture.Этот тест состоит из набора культур, которые определяют степень распознавания супругами антигенов тканевой совместимости друг друга.Лимфоцит - центральная клетка иммунной системы. Систему лимфоцитов можно сравнить с государством, где есть начальники и подчиненные, а каждый служащий выполняет специализированную функцию.Если лимфоцит встречает любые чужеродные для организма объекты (бактерии, вирусы, чужие клетки и т. д.), то развивается иммунный ответ. Если речь идет о чужих тканях или клетках, то степень иммунного ответа будет зависеть от похожести конфигурации антигенов тканевой совместимости (HLA, human leucocyte antigens, или MHC, major histocompatibility complex, (это синонимы) антигенов).Иммунный ответ выражается в появлении клонов (потомков одной клетки) клеток, строго специализированных к конкретным чужеродным факторам). Другими словами, если иммунные клетки начинают реагировать на что-то, они начинают делиться. А деление клеток можно оценить по скорости синтеза ДНК. Чем больше синтезируется ДНК - тем сильнее делятся клетки, тем активнее идет развитие иммунного ответа. Степень синтеза ДНК можно определить по включению в культуру клеток радиоактивного нуклеотида тимидина - «кирпичика» ДНК. На этом принципе основана оценка смешанной культуры лимфоцитов.Технически это делается следующим образом. У супругов берут кровь, из которой выделяют лимфоциты. Эти лимфоциты помещают в благоприятную для деления питательную среду. Если смешать лимфоциты разных людей, они начнут друг на друга реагировать. Однако если просто зарегистрировать активность смешанной культуры разных людей, невозможно понять, как реагирует конкретный человек, потому что «в бой» вступают клетки всех участников смешанной культуры.Для того, чтобы оценить индивидуальную реакцию каждого участника культуры, клетки одного из супругов подвергают воздействию, которое делает невозможным деление клеток. Однако антигенные свойства лимфоцитов при этом сохраняются. В такой культуре вся активность клеток будет связана только с живыми клетками другого супруга. Сравнивая различные комбинации культур живых и инактивированных клеток можно получить важную информацию о степени иммунологической похожести супругов.Фактически в этом анализе, очень трудоемком, ставится 12 различных культур, а оценка реакции проводится на 3-и и 5-е сутки культуры.Полученные 24 цифры позволяют получить важную информацию о том, как будет реагировать женщина на антигены тканевой совместимости мужа во время беременности.Дело в том, что сохранение беременности - активный процесс. Так же, как при реакции отторжения, для развития иммунологической толерантности на первом этапе важно адекватное иммунологическое распознавание пришельца. Если это распознавание вялое, или если оно происходит слишком поздно, зародыш атакуется естественными клетками киллерами матери и погибает.СКЛ позволяет не только оценить состояние иммунологического распознавания лимфоцитов супругов друг другом, но и проконтролировать процесс лечения с помощью иммунизации лимфоцитами, выбрать метод и дозу иммунизации, оценить перспективы применения того или иного способа коррекции.Поэтому при обнаружении «плохой» конфигурации цифр в СКЛ, часто приходится ее повторять уже после лечебных воздействий.Использование СКЛ, которое было начато в нашем центре с весны 2000 г., позволило значительно улучшить качество лечение пациенток с бесплодием, невынашиванием беременности и неудачными попытками IVF.
Вторая часть эфира 2 июля.
HLA-гены и иммунология репродукции. Кожный лоскут. Иммунизация лимфоцитами (ЛИТ). СКЛ - смешанная культура лимфоцитов. Иммунологический фактор при невынашивании беременности.
HLA-гены и иммунология репродукции
Так какая же система самая разнообразная внутри организма и что обеспечивает защиту от инфекций? Это система генов иммунитета - HLA-гены. Все эти гены располагаются на 6-й хромосоме и определяют индивидуальность иммунного ответа, чувствительность к тем или иным стимулам.
Вот здесь как раз речь заходит об иммунологии репродукции
, о том, чем занимается наш Центр. Если смотреть наш сайт, то можно увидеть, что существует так называемый аллоиммунный
фактор бесплодия и невынашивания беременности. Он связан с антигеном тканевой совместимости, с похожестью или непохожестью по антигенам тканевой совместимости. Риски в репро-дуктивном процессе профессора-имунолога Валентина Ивановича Гавалло, который является родоначальником иммунологии репродукции в нашей стране.
Иммунология репродукции не сразу развивалась, как отдельное направление. Иммунологов всегда интересовало множество других вещей, а иммунология репродукции была интересна в последнюю очередь. Но всё же, в процессе развития в этой области медицины, иммунология репродукции сформировалась в отдельное направление. В какой-то момент было найдено, что есть определённые вещества, которые назвали антигенами тканевой совместимости
или главным комплексом гистосовместимости
, или системой антиген-лейкоцитов человека
. Если эти компоненты совпадают у людей, то можно пересаживать органы и они будут приживаться в новом теле.
Кожный лоскут
Оказывается, что если во время беременности идёт непохожесть между плодом и матерью по антигенам тканевой совместимости, то в организме матери возникает ответ на эти антигены. Тогда в крови матери (и вообще, в крови рожавших женщин) можно обнаружить огромное количество антител против антигенов тканевой совместимости, которые плод наследовал от отца. И находясь внутриутробно, плод вызывал на себя иммунный ответ организма матери.
Исследователями было высказано предположение, что действие этих антител на плод очень вредно, так как в некоторых случаях они повреждали и убивали его. Такие случаи называют «привычное невынашивание беременности».
Для лечения этих случаев и сопутствующих осложнений нашли такой способ: у мужа брали лоскут кожи и подсаживали женщине, чтобы этот лоскут был иммуносорбентом
вредных антител, образовавшихся во время предыдущих беременностей. Тогда у плода появлялась возможность спокойно развиваться. Такое лечение невынашивания беременности начали проводить в Америке, в Чехословакии, и далее, в Европе, и оно действительно работало.
В какой-то момент и в России, в Москве решили заниматься таким лечением. В Институте акушерства и гинекологии была создана лаборатория клинической иммунологии, заведующей которой стала Лидия Сергеевна Волкова. Она обратилась с предложением сотрудничества к молодому тогда ещё Валентину Ивановичу Говалло, который простажировался в Чехословакии у Гашека, известного иммунолога-трансплантолога; и посетил лабораторию Дассе в Париже. Гавалло начал разработку систем тканевого типирования ещё в Институте травматологии и ортопедии, и проводил эксперименты по пересадке кожных лоскутов на мышах.
Одной из первых пациенток стала женщина, у которой ранее было 15 выкидышей. Сама беременность наступала у неё легко, но потом она не могла её выносить. И было проведено ей вышеописанное лечение с подсадкой кожного лоскута мужа, которое тоже прошло успешно. А после этой беременности у пациентки были ещё две последующие удачные беременности. И в то время данный случай просто потряс врачей, проводивших это лечение. С тех пор эта методика начала широко применяться в России и в сопредельных государствах.
Иммунизация лимфоцитами
А иммунология репродукции продолжала развиваться. Скоро поняли, что упомянутые кожные лоскуты - не сорбенты, а иммуностимуляторы,
вызывающие на себя реакцию отторжения. А эта методика - как раз та самая иммунизация, в процессе которой формируются антитела. И эти антитела - не повреждающего, а защитного характера. Они помогают вовремя распознать беременность внутри полости матки и включить на эту беременность адекватную реакцию, направленную на сохранение и выживание плода. Далее последовало совершенствование этой методики. Где-то на рубеже 70-80-х годов В.И.Говалло на одной конференции в Новосибирске задался вопросом о необходимости пересадки кожного лоскута. Гораздо проще, говорил он, взять из крови мужа лимфоциты
(клетки, имеющие на себе высокую концентрацию антигенов тканевой совместимости второго класса) и просто ввести их женщине. И дальнейший результат будет таким же. После конференции с ним связалась профессор Сидельникова, заведующая отделением невынашивания беременности, и предложила начать проводить процедуры иммунизации пациенток предложенным им способом.
И они стали проводить такие процедуры, а их пациентки стали успешно вынашивать беременность. А затем случилось так, что Валентин Иванович поссорился с профессором Сидельниковой, они стали работать отдельно и возникли два способа лимфоцитоиммунизации.
В Центре акушерства и гинекологии процедуру проводили, вводя препарат многократно в небольших количествах.
А по методу Говалло лимфовзвесь вводилась однократно в количестве 200-250 миллионов клеток, и наш Центр выбрал этот метод, хотя оба способа хорошо работают.
СКЛ - смешанная культура лимфоцитов
Валентин Иванович был основным нашим консультантом при создании и открытии клиники, помогал запустить свою методику у нас. Сейчас мы типируем пациентов на гены тканевой совместимости второго класса. При обнаружении такой похожести – делаем иммунизацию лимфоцитами мужа, только мы добавили сюда ещё и смешанную культуру лимфоцитов (СКЛ)
.
Объясню, почему. Когда ещё я работал на кафедре и учился в аспирантуре, где-то в конце 80-х годов, нашей клинической базой был 7-й роддом, самый близкий к Кремлю, на Воздвиженке. После занятий я шёл в библиотеку имени Ленина и просматривал все новинки в публикациях из разных стран мира.
Одной из них было интересное многотомное «Руководство по акушерству и гинекологии» из Германии, где невынашиванию беременности был посвящен отдельный том. И в этом томе была целая глава по иммунологии невынашивания беременности, где предлагалось использовать смешанные культуры лимфоцитов для выявления пар, которым действительно нужна иммунизация, и отсекать тех, кому не нужна эта процедура. Таким образом я знал про эту дополнительную методику и стал использовать в наших клиниках, хотя многие не применяют её из-за некоторой сложности. У нас в Центре это отдельная программа по аллоиммунному бесплодию.
Иммунологический фактор при невынашивании беременности: роль совпадений по HLA
Но замечу, что не стоит гипертрофировать проблему иммунологического фактора при невынашивании беременности. Да, он значим, но не является единственной проблемой невынашивания.
Здесь немного вернемся опять к истокам генетики. В какой-то момент развития теорий о половом размножении возникла эта идея про совместимость по тканевым антигенам. Потому что половое размножение даёт разнообразие прежде всего по антигенам тканевой совместимости, по антигенам белков иммунной системы. И тогда решили найти такую популяцию, где приветствуется многодетность, где не используют контрацепцию, и где ведут здоровый образ жизни. Чтобы легче было выявить факторы, влияющие на наступление и течение беременности. И нашли подходящую популяцию в виде христианской общины хаттеритов (Гуттерово братство).
В такой популяции имеется полная похожесть супругов по антигенам тканевой совместимости второго класса. И среди их супружеских пар было выявлено, что там увеличен период между началом половой жизни и рождением первого ребёнка; увеличено количество случаев невынашивания беременности; и увеличены интервалы между рождением детей. При этом нет случаев бесплодия. И почти во всех таких супружеских парах более 10-ти детей.
Из этого исследования можно сделать вывод, что всё-таки влияние фактора тканевой совместимости ограничено. Поэтому, когда у нас есть пара с похожестью генов тканевой совместимости (а таких пар всего примерно 15%) в сочетании с невынашиванием беременности, нужно проводить более углубленные обследования по всем направлениям, касающимся невынашивания беременности. Тогда точно может быть выявлена необходимость проведения процедуры лимфоцитоиммунизации.
Первые сообщения о смешанной культуре лимфоцитов (СКЛ) появились в 1964 г. в связи с феноменом бластрансформации. Изучение СКЛ основано на том же принципе, что и реакции бласттрансформации лимфоцитов (см. раздел «Реакция бласттрансформации лимфоцитов »). Сила реакции зависит от степени различия между антигенами гистосовместимости. HLA-A, -В-В- и -С-антигены на поверхности лимфоцитов соответствуют HLA-D-антигенам, которые могут быть выявлены только при помощи СКЛ. В то же время DR-антигены (D-related) могут быть обнаружены при помощи антисывороток (см. раздел «Комплементзависимая цитотоксичность. Типирование по HLA-DR.»). Гипотеза о том, что анти-DR-сыворотки позволяют осуществлять тонкое типирование всего локуса D, кажется в настоящее время менее вероятной, чем гипотеза о существовании двух различных локусов.
Хромосома 6 человека с HLA-комплексом и близко расположенными локусами (GLO; PGM 3).
В настоящее время точно установлено существование 12 антигенов DW и 10 антигенов OR. LD - 2 = минорный D-локус, существование которого можно предположить на основании рекомбинационного анализа
Даже для Iа-антигенов человека в настоящее время обсуждается трехлокусная модель, так что термин «DR» не следует более применять в качестве синонима понятия «человеческие молекулы II класса».
Для оценки реактивности (индивидуума) в отношении аллогенного раздражителя готовят так называемую одностороннюю СКЛ, при которой для стимуляции используют инактивированные клетки. Следует заметить, что даже инактивированные стимулирующие клетки (см. ниже) обладают способностью выделять митогенные факторы, а также до некоторой степени усиливать синтез ДНК и биосинтез иммуноглобулинов. Это может стать скрытым источником ошибок. На мышиной модели хорошо изучены взаимодействия, возникающие в ходе аллогенной реакции.
Механизм индукции аллогенной реакции для получения эффекта зависимого от клеток лимфоцитолиза (модификация описана в соответствующей работе)
MF - макрофаг; T lNDH -индуктор хелперных клеток; Т н - Т-хелпер; рТ с - предшественник цитотоксической клетки; Т с - цитотоксическая клетка; треугольник- DR-антиген; прямоугольник - HLA-A/B-антигены
Правда, до настоящего времени остается неясным, какие типы клеток участвуют в пролиферативном ответе. Исследование первичной реакции лимфоцитов на аллогенные клетки используется в следующих случаях:
Проверка СКЛ-реактивности в качестве критерия оценки клеточного иммунитета;
Типирование HLA-D;
Выяснение взаимозависимости между HLA-D-антигенами и предрасположенностью к определенным заболеваниям;
Выбор пары донор - реципиент.
2.2. Методы клеточных взаимодействий
В основе почти всех методов клеточных взаимодействий, используемых клинической иммуногенетикой, лежит феномен бластооб- разования в смешанной культуре лимфоцитов, открытый канадской исследовательницей Барбарой Бейн . Реакция смешанной культуры лимфоцитов (mixed lymphocyte culture - MLC) позволила осуществить тонкое дифференцированное изучение комплекса HLA и, в частности, одной из его субъединиц - локуса HLA-D. Ряд других методов клеточных взаимодействий - клеточно-опосредованный лимфолизис (Cell-mediated Lympholysis - CML), тест примирования лимфоцитов (Primed Lymphocyte Typing) - основывается на методе MLC или содержит его как составную часть.
2.2.1. Смешанная культура лимфоцитов (MCL)
Принцип метода изображен на рис. 10, из которого видно, что две популяции различающихся генетически лимфоцитов взаимодействуют между собой в культуре in vitro. Одна из популяций обрабатывается митомицином С или облучается, в результате чего теряет способность к бластообразованию и включению тимидина (3 НТ), однако, не теряя антигенных свойств, сохраняет способность к стимуляции (стимуляторы; S-популяция).
Клетки, отвечающие на стимуляцию (респондеры, R-популяция), через несколько дней трансформируются в бласты и включают тимидин, добавляемый в культуру. Интенсивность реакции измеряется с помощью радиационной метки по включению 3 Н-тимидина.
Известны несколько вариантов реакции смешанной культуры лимфоцитов, из которых здесь предлагаются два: традиционный и микровариант, реализуемый в планшетах Cook (рис. 11).
Рис. 11. Оборудование для микровариантов MLC и CML. 1 - планшет круглодонный е 96 лунками; 2-автоматическая пипетка ("Pipetman") с программой для разных объемов; 3 - автоматическая пипетка ("Sigma") для определенного объема; 4 - наконечник для пипетки одноразового использования; 5 - ламинарный бокс
Традиционный вариант MLC (модификация Ф. С. Барановой):
Лимфоциты выделяют на фиколл-урографиновом градиенте, как описано выше. Первую отмывку производят в PBS (NaCl - 8,0 г, Na 2 HP0 4 - 1,15 г, KH 2 PO 4 - 0,2 г, KC1 - 0,2 г на 1л H 2 O); две последующие производят в среде 199 с 5%-АВ-сыворотки (пул от 15 доноров);
Отвечающие клетки ресуспендируют в среде 199 с 10% сывороткой АВ и доводят концентрацию клеток до 0,6 x 10 6 в 1 мл;
Выделенные таким же образом стимулирующие клетки в концентрации 5 - 10 6 в 1 мл обрабатывают митомицином С (60 γ/мл) фирмы "Serva" и инкубируют 40 мин при 37°С в водяной бане. После инкубации клетки отмывают 3 раза средой 199 с 5% сывороткой АВ, ресуспендируют в среде 199 с 10% сывороткой АВ, доводя концентрацию до 0,6 x 10 6 в 1 мл;
0,5 мл отвечающих клеток и 0,5 мл стимулирующих клеток смешивают в центрифужной пробирке, прибавляют 0,04 мл 10 мл р-ра Hepes ("Serva") и инкубируют 144 ч; опыт ставят в трех параллелях (триплет);
За 24 ч до окончания инкубации в пробирки добавляют 3 Н-тимидин 1μCi (3,7x10 4 БК), на пробу удельной активности 5mСi/мМоль (18,5x10 7 БК/мМоль) и продолжают инкубацию;
По окончании инкубации клетки переносят на миллипоровые фильтры (0,6 - 0,9 микрон), промывают физиологическим раствором (37°С) и охлажденным 5% раствором трихлоруксусной кислоты (4°С). Фильтры сушат и помещают во флаконы с 5 мл сцинтилляционной жидкостью (5 г РРО и 0,5 г РОРОР - на 1 л толуола) * . Активность включения 3 Н-тимидина замеряют на β-счетчике; результат выражают в абсолютных включениях радиоактивной метки в 1 мин или в индексе стимуляции (ИС) по формуле:
* (РРО - 2,5-фенол-оксазол; РОРОР - (1,4-ди-2-15-фенолоксазолитбензол). )
Среднее значение СРМ в трех опытных образцах
ИС = Среднее значение СРМ в трех контрольных образцах/Контрольными образцами служат спонтанные культуры отвечающих клеток.
Микровариант MLC в планшетах Cook . На 8-м Уоркшопе выработаны требования, стандартизирующие микровариант MLC, в соответствии с которыми он излагается ниже :
Лимфоциты выделяют в градиенте изопак-фиколла и ресуспендируют в среде RPMJ-1640 * , доводя концентрацию до 5х10 5 в 1 мл;
* (Можно использовать среду 199, смешанную с человеческой сывороткой группы АВ (5% сыворотки, взятой от нескольких индивидов). )
Клетки-стимуляторы обрабатывают митомицином С или обучением;
5x10 4 репондеров и столько же стимуляторов помещают с помощью микропипетки типа Pipetman в каждую лунку круглодонного микропланшета Cook;
Планшеты инкубируют в термостате с автоматической подачей 5% CO 2 в течение 120 ч; затем в каждую лунку вносят lμmCi 3 Н-тимидина при специфической активности тимидина 6 Ci/мМоль; все манипуляции проводят пипеткой Pipetman;
Через 16 ч после внесения тимидина культуры из каждой лунки автоматической пипеткой переносят на миллипоровые фильтры и промывают физиологическим раствором, а затем 5% трихлоруксусной кислотой; удобно использовать специальные "харвестеры" для переноса культуры на миллипоровые фильтры;
Активность включения тимидина определяют, как описано выше.
2.2.2. Клеточно-опосредованный лимфолизис (CML)
CML используется в иммуногенетических исследованиях сравнительно недавно (с 1972 г.), однако в последнее время становится все более популярной техникой, позволяя детально изучить роль эфферентного звена трансплантационного иммунитета и завоевывая признание как информативный метод иммунологического мониторинга. Принцип метода изображен на рис. 12. В основе метода лежит техника, предложенная J. Lightbody (1971), которая вкратце сводится к следующему.
1. CML начинается с обычного HLC-теста, в котором происходит распознавание отвечающими клетками "стимуляторов", сенсибилизация отвечающих клеток и формирование сенсибилизированных киллеров.
2. Вторая фаза, в которой сенсибилизированные киллеры смешиваются с меченными 51 Сr клетками-мишенями, состоит в деструкции последних эффекторными клетками-киллерами; клетки- мишени могут иметь генотип такой же, как "стимуляторы" в первой фазе MLC, а могут быть клетками "третьего" партнера", наделенными общими со "стимуляторами" антигенными детерминантами или без них.
3. Количество радиоактивного хрома, высвобождающегося из разрушенных клеток-мишеней и выходящего в культуральную среду, служит мерой интенсивности киллер-эффекта.
Рис. 12. Принцип клеточно-опосредованного лимфолизиса (CML). I ряд - сенсибилизация отвечающих клеток, образование киллеров; II ряд - взаимодействие киллеров с мишенью; III ряд - разрушение клетки-мишени; выход 51 Cr культуральную среду
Здесь описано три варианта CML: традиционный вариант в модификации Л. П. Алексеева (1979), микровариант в планшетах Cook, прямая CML (Direct-CML -D-CML.
Традиционный вариант [Алексеев Л. П., 1979].
Метод разделен на несколько этапов.
Получение киллеров :
Периферические лимфоциты обеих популяций (R-клетки и S-клетки) выделяют обычным путем, в градиенте плотности отмывают трижды в среде 199 с 5% АВ-сывороткой (10 мин, 150 g);
1x10 6 R-клеток (0,8 мл) смешивают в центрифужных пробирках с 2x10 6 S-клеток (0,2 мл), обработанных митомицином С, и инкубируют 144 ч при 37°С;
Клетки центрифугируют при 150 g в течение 10 мин, а осадок ресуспендируют в среде 199 с добавлением 20% телячьей сыворотки (среда 199 + т. е.), доведя концентрацию до 1x10 6 в 1 мл;
Одну из проб оставляют для исследования уровня MLC, остальные используют как готовые киллеры.
Получение мишеней :
Выделенные обычным путем лимфоциты ресуспендируют в среде 199 с 20% АВ-сывороткой и инкубируют с фитогемагглютинином (0,003 мг/мл Wellcome) в течение 72 ч при 37°С; концентрация клеток 1x10 6 в 1 мл;
Клетки центрифугируют 10 мин при 150 g, осадок ресуспендируют в среде 199 с 5% АВ-сывороткой и доводят концентрацию клеток до 2x10 4 в 1 мл;
К взвеси добавляют 51 Cr 100 μCi/мл (3,7x10 6 БК/мл) и инкубируют 40 мин при 37°С;
Клетки трижды отмывают в среде 199 с добавкой 5% АВ-сыворотки (150 g, 10 мин) и осадок ресуспендируют в среде 199 с 5% АВ-сывороткой,. доведя концентрацию до 2x10 4 в 1 мл.
Постановка реакций :
5x10 5 киллеров (0,5 мл) смешивают с 1x10 4 мишеней (0,5 мл), инкубируют 4 ч (37°С) и центрифугируют при 150 g 10 мин;
Суспернатант отсасывают и на?-счетчике подсчитывают импульсацию, вызываемую 51 Cr; подсчет ведут в 0,5 мл супернатанта;
Уровень цитолиза подсчитывают по следующей формуле:
экепер. выход 51 Cr - спонтанный выход 51 Cr/максим, выход 51 Cr - спонтанный выход 41 Cr × 100.
Спонтанный выход хрома измеряется на мишенях, инкубированных 4 ч (37°С) без клеток-киллеров; максимальный выход хрома - на мишенях, полностью разрушенных замораживанием-оттаиванием; все пробы осуществляются в триплетах.
Микровариант CML в планшетах [по Mawas С., 1976]:
Фаза получения киллеров осуществляется как MLC в круглодонных планшетах, но смешивают в равных количествах R- и S-клетки по 2x10 5 па каждую лунку и инкубируют при 37°С;
Через 5 сут клетки собирают пастеровской пипеткой в пробирку, подсчитывают с трипаном голубым число живых и доводят концентрацию до 10x10 6 в 1 мл;
Клетки-мишени в течение 3 дней культивируют с ФГА;
В день постановки реакции клетки-мишени отмывают (300 g) и ресуспендируют в культуральной среде, распределяя по 1 мл в пробирки и доводя до 1x10 6 в 1 мл;
Добавляют в каждую пробирку с клетками-мишенями по 200 μCi 51 Cr(7,4x10 6 БК) и инкубируют 1 ч при 37°С; отмывают клетки 3 раза; осадок ресуспендируют и доводят до концентрации 1x10 в 1 мл (живых);
Тест реализуется в круглодонных микропланшетах; для этого распределяют в каждую лунку 0,7 - 1x10 6 клеток-киллеров (0,1 мл) и 1x10 4 клеток-мишеней (0,1 мл); общий объем суспензии в каждой лунке 0,2 мл, добавляют в каждую лунку по 0,05 мл среды и инкубируют (37°С) 4 ч;
Планшеты центрифугируют при 800 g на центрифуге Beckman в течение 10 мин; супернатант из каждой лунки переносят в пробирки и подсчитывают на γ-счетчике;
Фазу получения киллеров (MLC) проводят на среде RPMJ-1640 с добавлением 20% человеческой плазмы; для фазы киллинга употребляют среду MEM с добавлением 20% человеческой плазмы, предварительно прогретой.
Прямая CML (D-CML). Прямая CML является техникой, созданной специально для клинических целей, нашедшей использование при иммунологическом мониторинге. Схема этой реакции изображена на рис. 13.
Основное отличие от традиционной CML состоит в том, что стадия образования киллеров (фаза сенсибилизации) протекает не in vitro, a in vivo, т. е. в организме человека, сенсибилизированного пересадкой аллогенного органа или ткани. Вследствие воздействия аллогенной ткани лимфоциты реципиента сенсибилизированы к тканевым антигенам донора и не нуждаются в специальной обработке in vitro, продолжительность теста значительно сокращается во времени, так как предварительно следует подготовить только мишени.
В качестве мишеней используют лимфоциты, полученные из периферической крови или, чаще, из селезенки донора (см. 2.1.2) и замороженные любым из описанных выше способов (см. 2.1.3).
2.2.3. Антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (Antibody-dependent-cell mediated Cytotoxicity - ADCC)
Этот тип клеточных реакций сходен по механизмам действия с описанной выше CML. Принцип реакции изображен на рис. 14. Компонентами реакции являются клетки-мишени (донорские клетки или аллогенные лимфоциты), сыворотка (аллогенная или реципиента), предположительно содержащая антитела, направленные к детерминантам клеток-мишеней, и клетки-эффекторы (лимфоциты реципиента или аллогенные лимфоциты).
Клетками-эффекторами в данном типе взаимодействия служат так называемые К-клетки, находящиеся в периферической крови. В отличие от клеток-киллеров в CML они осуществляют цитотоксический эффект без предварительной сенсибилизации, однако проявление цитотоксического действия К-клеток возможно только через посредство антител, направленных к детерминантам клеток-мишеней . Специфический лизис измеряется по высвобождению 51 Cr, если исследуемая сыворотка содержит антитела к детерминантам мишеней.
Детерминантами-мишенями в ADCC могут быть практически специфичности всех HLA-локусов, включая HLA-D, HLA-DR, а также детерминанты, лежащие вне HLA-системы .
Наибольшее распространение эта сложная реакция получила в иммунологическом мониторинге для выявления В-клеточных антител. В связи с этим было предложено несколько модификаций, предусматривающих обогащение суспензии клеток-мишеней В-лимфоцитами, адсорбцию сывороток на тромбоцитах и т. д.
Помимо всего, учитывается ряд других особенностей реагирования в данной системе. Исследуемая сыворотка должна быть декомплементирована, так как в противном случае реакция может пойти по типу антитело-опосредованной комплементзависимой цитотоксичности. Предполагается также, что клетки-эффекторы могут вызвать определенную деструкцию мишеней по типу CML.
В конечном итоге весь набор проб в тесте антителозависимок клеточно-опосредованной лимфоцитотоксичности следующий:
Мишени + эффекторы + испытуемая сыворотка (опытная проба);
Мишени (контрольная проба, т. е. спонтанное высвобождение 51 Cr);
Мишени + эффекторы (контрольная проба на активность эффекторов);
Мишени + испытуемая сыворотка (сывороточный контроль).
Лимфоциты выделяют обычным образом и ресуспендируют в RPMI-1640 + 10% эмбриональной телячьей сыворотки; обрабатывают суспензию карбонильным железом для удаления моноцитов; добавляют аммония хлорид или H 2 O для лизиса оставшихся эритроцитов;
В суспензию клеток-мишеней добавляют 51 Cr в форме р-ра Na 2 CrO 4 100 - 200µCi мл (3,7x10 6 - 7,4x106 БК/мл) и инкубируют 40 - 60 мин;
Клетки трижды отмывают в RPMI +0,1% HSA, ресуспендируют в той же среде и доводят до 2x10 8 в 1 мл; 50 µl суспензии меченых клеток помещают в пробирку и в дальнейшем подсчитывают изотопную активность на γ-счетчике для выявления полного изотопного "усвоения"; остальное раскапывают в лунки планшета по 50 µl суспензии (1x10 5 клеток на лунку);
Суспензия клеток-эффекторов доводится до 2x10 7 кл в 1 мл и в. каждую лунку помещают 50 µl суспензии (или 100 µl), соотношение эффекторов и мишеней 10:1 (или 20:1);
Инкубация продолжается 4 ч во влажной атмосфере термостата с 5% CO 2 (длительность инкубации может быть продолжена до 8 ч);
Приготовляют в пробирках несколько разведений испытуемой сыворотки (1:25; 1:100) и добавляют в лунки до 50 µl каждого разведения: и неразведенную сыворотку; окончательная постановка теста выглядит, как показано в табл. 23.
Таблица 23
Постановка ADCC. Все варианты проб, µl
* (Вместо испытуемой сыворотки закапывают пул АВ-сывороток. )
** (Вместо испытуемой сыворотки закапывают моноспецифическую HLA-сыворотку, направленную против мишеней (не эффекторов). )
Инкубация панелей продолжается 4 ч во влажной атмосфере с 4% CO 2 ; длительность инкубации может быть продолжена до 8 ч;
После инкубации половину объема из каждой лунки (100 μl) осторожно отсасывают автоматической пипеткой и помещают в пробирки для подсчета импульсации 51 Cr; активность подсчитывают на γ-счетчике;
Вычисления следующие:
% высвобождения 51 Cr = 2 × А оп - фоновая активность/В - фоновая активность × 100;
% цитотоксичности = А оп - А сп /100 - А сп × 100, где А оп - % высвобождения 51 Cr в опытных пробах; А сп - % спонтанного высвобождения; В - полное усвоение изотопа.
Как положительный результат рассматривается 5% и выше цитотоксичность после 4 ч инкубации.