Этапы пцр. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и ее применение

Главная

Переломы

Сайт предоставляет справочную информацию исключительно для ознакомления. Диагностику и лечение заболеваний нужно проходить под наблюдением специалиста. У всех препаратов имеются противопоказания. Консультация специалиста обязательна!

Метод полимеразной цепной реакции был открыт почти тридцать лет назад американским учёным по имени Кэрри Мюллис . Методика широко распространена в медицине в качестве диагностического инструмента, и суть её состоит в копировании участка ДНК при помощи специального фермента (полимеразы ) искусственным путём в пробирке.

В каких областях медицины применяется этот метод?

Для чего выполняется копирование ДНК и как это может послужить медицине?
Данная методика позволяет:

Выделять и клонировать гены.
Диагностировать генетические и инфекционные заболевания.
Определять отцовство. Ребенок частично наследует от своих биологических родителей генетические особенности, однако имеет при этом свою собственную уникальную генетическую идентификацию. Наличие у него некоторых генов, идентичных родительским генам – позволяет говорить об установлении родства.

Полимеразная цепная реакция применяется также в криминалистической практике.

На месте преступления судмедэксперты собирают образцы генетических материалов. К ним относятся: волосы, слюна, кровь. Впоследствии, благодаря методике полимеразной реакции, можно амплифицировать ДНК и сравнить идентичность взятой пробы с генетическим материалом подозреваемого человека.

В медицине эффективно используется полимеразная цепная реакция:

В пульмонологической практике – для дифференциации бактериальных и вирусных видов пневмонии , туберкулёза .
В гинекологической и урологической практике – для определения уреаплазмоза , хламидиоза , микоплазменной инфекции , гарднереллеза , герпеса , гонореи .
В гастроэнтерологической практике.
В гематологии – для определения онковирусов и цитомегаловирусной инфекции .
В экспресс-диагностике таких инфекционных заболеваний как вирусные гепатиты , дифтерия , сальмонеллёз .

В настоящее время наиболее распространен данный метод в диагностике инфекционных болезней (гепатитов вирусной этиологии, ВИЧ , венерических заболеваний , туберкулёза, клещевого энцефалита ).

Что происходит во время протекания реакции?

Сама реакция является химически несложной. Источником ДНК для реакции может послужить капля крови, волос, кусочек кожи, и т.д. В теории, для проведения реакции требуются нужные реагенты, пробирка, проба из биологического материала и источник тепла.

Полимеразная реакция позволяет выявить инфекцию, даже если в пробе с биологическим материалом находится всего одна или несколько ДНК-молекул возбудителя.

Во время протекания реакции, благодаря ферменту ДНК-полимеразы, происходит удвоение (репликация ) участка ДНК. Сама же дезоксирибонуклеиновая кислота (сокращенно ДНК ) важна для нас тем, что обеспечивает хранение и передачу дочерним клеткам генетической информации. ДНК имеет вид спирали, которая состоит из повторяющихся блоков. Эти блоки составляют нуклеотиды, которые являются наименьшей частицей ДНК. Нуклеотиды образуются из аминокислот.

Процесс репликации участков ДНК происходит во время повторяющихся циклов. В каждый такой цикл копируется и удваивается не только исходный фрагмент ДНК, но и те фрагменты, которые уже удвоились в прошлый цикл амплификации. Все это напоминает процесс геометрической прогрессии.

Существует:

Естественная амплификация (то есть процесс копирования и размножения ДНК ), которая происходит в нашем организме и является детерминированным, предопределённым процессом.
Искусственная амплификация, которая происходит благодаря полимеразной цепной реакции. В этом случае процесс копирования является управляемым и позволяет удвоить даже короткие участки нуклеиновой кислоты.

После завершения каждого цикла копирования, количество фрагментов нуклеиновой кислоты возрастает в геометрической прогрессии. Именно поэтому сам процесс называют «цепной реакцией».

Спустя тридцать - сорок циклов число фрагментов достигает нескольких миллиардов.

Для амплификации in vitro (в пробирке ) необходимо, чтобы в биосреде, взятой для диагностики, присутствовал специфический чужеродный фрагмент ДНК (то есть ДНК не пациента, а возбудителя ). Если в созданном растворе не будет находиться специфический фрагмент – цепная реакция под действием полимеразы не пойдет. Этим и объясняется факт высокой специфичности ПЦР.

Этапы ПЦР-диагностики

1. Из исследуемого материала выделяют ДНК.
2. Добавляют ДНК в специальный раствор из нуклеотидов.
3. Нагревают раствор до температуры 90 - 95 градусов Цельсия, для того, чтобы белок ДНК свернулся.
4. Снижают температуру до 60 градусов.
5. При повторении циклов повышения-понижения температуры количество участков нуклеиновой кислоты возрастает.

6. Путём проведения электрофореза подводится итог, и подсчитываются результаты удвоения.

Какие преимущества имеет данная диагностика?

Универсальность: для этого метода подходят любые образцы нуклеиновой кислоты.
Высокая специфичность: возбудитель имеет уникальные последовательности цепочек ДНК, которые свойственны именно ему. Поэтому результаты проведённой ПЦР будут достоверными, в них невозможно спутать ген одного возбудителя с геном другого возбудителя.
Чувствительность к наличию даже единичной молекулы возбудителя.

Маленький объем материала, нужного для исследования. Подойдет даже капля крови. Возможность получить результат, использовав минимальный объём пробы, очень важна для педиатрических, неонатологических, неврологических исследований, а также в практике судебной медицины.
Возможность определения вялотекущей, хронической инфекции, а не только острой.
Многие болезнетворные культуры очень сложно культивировать в пробирке другими методиками, а полимеразная реакция позволяет размножить культуру в нужном количестве.

Какие недостатки имеет данная диагностика?

Если в материале, предназначенном для проведения ПЦР, находится ДНК не только живого возбудителя, но и погибшего – будет происходить амплификация обеих ДНК. Соответственно, лечение после диагностики может быть назначено не совсем верное. Через некоторое время лучше пройти контроль эффективности проведённого лечения.
Повышенная чувствительность к наличию микроорганизмов тоже может считаться, в некотором роде, недостатком. Ведь в норме в человеческом организме присутствует условно-патогенная микрофлора, то есть это микроорганизмы, которые живут в кишечнике , желудке , других внутренних органах. Эти микроорганизмы могут принести вред человеку только при определенных неблагоприятных условиях – несоблюдение гигиенических требований, загрязненная питьевая вода и т.д. ПЦР-методика амплифицирует ДНК даже этих микроорганизмов, хотя они и не приводят к патологии.
ПЦР разных тест-систем может показывать результаты, которые будут разниться между собой. Существует много модификаций данной методики: «вложенная », «ассиметричная », «инвертированная », «количественная » ПЦР и другие.

Анализ ПЦР – современный и высокоточный метод диагностики, позволяющий выявлять возбудителя инфекции независимо от стадии патологии. На сегодня этот способ обследования признан наиболее достоверным, так как он исключает получение ложных данных благодаря высокому уровню специфичности.

Суть метода ПЦР

Анализ ПЦР – полимеразная цепная реакция , позволяющая многократно увеличить объем микробной среды и определить возбудителя. Явление ПЦР было открыто в 20 веке американским ученым Кэри Мюллисом, благодаря которому в разы сократилось время постановки точного диагноза, а следовательно, врачи стали быстрее назначать адекватные терапевтические мероприятия.

Суть анализа ПЦР заключается в многократном увеличении фрагментов ДНК возбудителя, полученного из биологических проб пациента (мочи, крови, слюны и других). Эта методика позволяет увеличить в искусственной среде определенные участки генетического материала при помощи специальных ферментов, к тому же количество исследуемых фрагментов растет до такой степени, что можно их визуально исследовать.

Стоит отметить, что при анализе ПЦР копируются только определенные участки, играющие важную роль в диагностике. Если они присутствуют в организме пациента в ничтожно малом количестве, то этот анализ сможет их выявить.

Методика ПЦР активно используется в медицинской практике для изучения инфекционных и наследственных заболеваний, ведь помимо простого увеличения количества генетического материала (амплификации), он позволяет сращивать отдельные фрагменты ДНК и вводить мутации, осуществляя контроль за генами, которые вызывают опасения.

Что выявляет анализ ПЦР

Анализ ПЦР широко применяется в различных сферах медицины. Конечно, чаще всего он используется в гинекологии и урологии, но методика актуальна и для пульмонологии, фтизиатрии, гастроэнтерологии, онкологии и других областей.

Анализ ПЦР позволяет выявить вирусы на различных стадиях заболевания, также он способен выявить скрытые или «спящие» микроорганизмы, которые не вызывают появления клинических признаков:

Вирус папилломы человека разных типов (ВПЧ);
Хламидии;
Трихомонады;
Возбудителя гонореи;
Микоплазмы;
Уреаплазмы;
Гарднереллы;
Грибы кандида;
Микробактерии туберкулеза;
Вирусы гепатита А, В и С;
Хеликобактерии;
Вирусы герпеса;
Цитомегаловирусы (ЦМВ);
Вирусы Эпштейна-Барра.

Преимущества анализа ПЦР

Высокая точность анализа: риск получения ложноотрицательных результатов минимален;
Специфичность методики: анализ ПЦР позволяет выделить конкретный возбудитель инфекции, его вид и тип;
Повышенная чувствительность: анализ ПЦР определяет даже несколько фрагментов ДНК микроорганизма;
Возможность исследования разных биологических сред организма;
Скорость получения результатов: их можно получить через 4-5 часов после процедуры;
Возможность выявления нескольких микроорганизмов из одной пробы биологического материала.

Анализ ПЦР активно используется врачами разных специальностей, при этом отодвигаются на второй план другие методы диагностики. Стоит отметить, что эта процедура позволяет выявить носителей инфекции и латентные формы болезни, при которых нет клинических проявлений, но эти возбудители негативно отражаются на общем состоянии организма и его функциональности, а пациенты представляют опасность для окружающих.

Подготовка и проведение анализа ПЦР

Фрагменты ДНК микроорганизмов находятся в разных биологических средах пациента. Врачи сами определяют области взятия материалов для анализа ПЦР, которые зависят от типа заболевания и его локализации. Если вы обратились к венерологу с целью выявления инфекций, передающихся половым путем (ИППП), то будут исследованы выделения из половых органов (мазок или соскоб с шейки матки, влагалища) и мочеиспускательного канала, а также кровь и моча.

Герпетические инфекции и мононуклеоз диагностируются на основании анализа мазков из полости рта пациента. ЦМВ подтверждается после обследования мочи, спинномозговой жидкости. В отделении пульмонологии для анализа ПЦР берут мокроту и содержимое плевральной полости. У беременных при подозрении на внутриутробные инфекции плода исследуют околоплодные воды и ткани плаценты.

Чтобы исключить вероятность ошибочных результатов и повысить точность анализа ПЦР, перед сдачей биологического материала следует придерживаться несложных рекомендаций:

Большая часть микробов вымывается вместе с мочой, поэтому перед взятием мазка из уретры не стоит мочиться;
В течение 3-5 суток следует воздержаться от половых отношений;
Анализ ПЦР не проводится сразу после прекращения менструальных выделений, следует подождать 5-7 дней;
За 4 часа до сдачи слюны необходимо отказаться от приема лекарственных препаратов и пищи, а перед процедурой рекомендуется прополоскать рот водой и провести легкий массаж в области щек;
Мочу следует собирать в утренние часы в стерильный контейнер, для исключения загрязнения материала перед его взятием следует подмыться, женщинам ввести стерильный тампон во влагалище, а мужчинам максимально оттянуть складку крайней плоти;
За сутки до сдачи материала надо воздержаться от приема алкоголя, острой пищи и горячих процедур (сауны, бани и т.п.);
За 2 недели до анализа ПЦР необходимо прекратить прием антибактериальных средств;
За неделю до обследования приостанавливают использование интимных гелей, мазей и вагинальных свечей.

Это довольно простые правила, но они помогут получить максимально достоверные результаты и снизить риск ошибок в диагностике.

Расшифровка анализа ПЦР

Результаты анализа ПЦР могут быть положительными или отрицательными. Отрицательный результат исследования свидетельствует об отсутствии инфекции в биологических материалах.

Положительный результат подтверждает наличие микроорганизмов, но для постановки точного диагноза необходимы сведения об их количестве. Ведь в нашем организме присутствуют условно-патогенные микробы, которые становятся причинами заболеваний только в результате активного роста и размножения. Основываясь на количественных данных анализа ПЦР, врач может выяснить стадию развития патологического процесса, его активность, подобрать специфическое лекарственное средство и его дозировку.

Анализ ПЦР во время беременности

Беременность – это особенный период в жизни каждой женщины. В это время многие ИППП или латентные инфекции могут быть крайне опасными для малыша и вызвать преждевременные роды, выкидыш, пороки и аномалии развития. Поэтому анализ ПЦР проводят всем беременным в плановом порядке преимущественно на ранних сроках (до 12 недель), но иногда назначают и во время 2 триместра.

Материал берут из канала шейки матки и уретры, процедура безболезненная и не представляет угрозы. В большинстве случаев, анализ ПЦР проводят по поводу хламидий, уреаплазм, микоплазм, цитомегаловируса, герпеса и ВПЧ. Именно эти микроорганизмы представляют угрозу во время беременности. Но иногда женщины проходят комплексный анализ ПЦР, который включается в себя исследование на большое количество микроорганизмов (12 и более).

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – метод высокой точности в области диагностирования наследственных патологий, инфекций, вирусных болезней в любой стадии (острой или хронической), а также - на раннем этапе - до очевидных проявлений болезни путем идентификации возбудителей, на основе их ДНК, РНК, являющихся генетическим материалом, в пробах, которые получают от пациента. И сегодня мы поговорим про суть, этапы диагностики и принципы методов полимеразной цепной реакции (ПЦР), а также о ее стоимости.

Что такое полимеразная цепная реакция

Основа анализа - амплификация (удвоение) – создание множества копий из короткого участка ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоты), представляющей генетический комплекс человека. Для исследования нужно очень малое количество физиологического вещества (мокрота, каловые массы, соскоб эпителия, сок простаты, кровь, сперма, околоплодные воды, слизь, ткань плаценты, моча, слюна, жидкость плевральная, цереброспинальная). При этом, например, в мочеполовом тракте больного возможно обнаружение даже единичного вредоносного микроба.

Методику ПЦР (полимеразной цепной реакции) разработал американский ученый К. Мюллисом, в 1993 получивший Нобелевскую премию.

Активно используется:

в раннем диагностировании инфекций, генетических, ;
в судебно-медицинской экспертизе при наличии для исследования крайне малого количества ДНК;
в ветеринарной медицине, фармацевтике, биологии, молекулярной генетике;
для идентификации личности по ДНК, подтверждения отцовства;
в палеонтологии, антропологии, экологии (при отслеживании качества продуктов, факторов внешней среды).

О том, что такое полимеразная цепная реакция, расскажет в подробностях данное видео:

Кому ее назначают

Полимеразная цепная реакция в диагностике инфекционных заболеваний - одна из наиболее надежных методик особой точности и достоверности. К примеру, достоверность проведенного анализа ПЦР на хламидии и на многие другие патогены приближается к 100% (абсолютная). Чаще всего процедуру полимеразной цепной реакции назначают пациентам, у которых при диагностировании возникают сложности с идентификацией конкретного возбудителя.

Лабораторный тест ПЦР применяют:

для обнаружения болезнетворных организмов, вызывающих инфицирование мочевыводящих и половых органов, трудно идентифицируемых при использовании посевов или методов иммунологии;
для повторного диагностирования ВИЧ на начальной стадии в случае положительного, но вызывающего сомнения результата первичного анализа (например, у новорожденных от инфицированных СПИДом родителей);
для установления онкологического заболевания на раннем этапе (изучение мутаций онкогенов) и индивидуальной коррекции схемы лечения у конкретного пациента;
с целью раннего выявления и потенциального лечения наследственных патологий.

Так, будущие родители сдают анализ, чтобы узнать, являются ли они носителями генетической патологии, у детей ПЦР определяет вероятность подверженности болезни, передающейся по наследству.

для обнаружения патологий плода на раннем сроке вынашивания (отдельные клетки растущего эмбриона исследуют на наличие возможных мутаций);
у пациентов перед трансплантацией органов – для «тканевого типирования» (определения совместимости тканей);
для выявления опасных патогенных организмов в донорской крови;
у новорожденных малышей – для выявления скрытых инфекций;
для оценки результатов антивирусного и антимикробного лечения.

Зачем проходить такую процедуру

Поскольку ПЦР - высокоэффективный способ диагностики, дающий почти 100% результат, процедуру используют:

для подтверждения или исключения окончательного диагноза;
быстрой оценки эффективности проводимой терапии.

Во многих случаях ПЦР - единственно возможный тест для обнаружения развивающегося заболевания, если прочие бактериологические, иммунологические и вирусологические методики диагностирования оказываются бесполезными.

Вирусы обнаруживаются с помощью процедуры ПЦР сразу после инфицирования и до появления признаков болезни. Раннее выявление вируса позволяет оперативно назначить лечение.
Так называемая «вирусная нагрузка» (или - количество вирусов в организме) также определяется при анализе ДНК количественным методом.
Конкретные болезнетворные организмы (например, туберкулезную палочку Коха) сложно и слишком долго культивировать. Анализ ПЦР позволяет быстро выявить минимальное количество патогенов (живых и мертвых) в образцах, удобных для исследования.

Подробный анализ ДНК патогена используется:

чтобы определить его чувствительность к конкретным видам антибиотиков, что позволяет немедленно приступить к лечению;
чтобы контролировать распространение эпидемий среди домашних, диких животных;
чтобы выявить и отслеживать новые заразные виды микробов и подтипы патогенов, которые спровоцировали предыдущие эпидемии.

Виды диагностики

Стандартный метод

Анализ полимеразно-цепной реакции проводится на основе многократной амплификации (удвоения) конкретного фрагмента ДНК и РНК при использовании особых ферментов-праймеров. В результате цепочки копирования получается количество материала, достаточное для исследования.

В ходе процедуры копируется только искомый фрагмент (соответствующий заданным конкретным условиям) и в случае, если он действительно присутствует в пробе.

О том, как проходит ПЦР, рассказывает это подробное видео с полезными схемами:

Другие методы

ПЦР, проводимая в режиме реального времени . В этом виде исследования процесс выявления заданного фрагмента ДНК запускается после прохождения каждого цикла, а не после осуществления всей цепочки 30 – 40 циклов. Этот вид исследования позволяет получить информацию о количестве патогена (вируса или микроба) в организме, то есть осуществлять количественный анализ.
ОТ-ПЦР (режим обратной транскрипции) . Этот анализ используют, чтобы найти РНК с одной цепочкой для обнаружения вирусов, генетической базой которых является именно РНК (например, вирус гепатита С, иммунодефицита). При таком исследовании используется особый фермент - обратная транскриптаза и определенный праймер и на базе РНК строится одноцепочная ДНК. Затем из этой цепочки восстанавливают вторую цепь ДНК и выполняется стандартная процедура.

Показания для проведения

Процедура ПЦР применяется в клинике инфекционных болезней, неонатологии, акушерстве, педиатрии, урологии, гинекологии, венерологии, неврологии, нефрологии, офтальмологии.

Показания для назначения анализа:

выяснение риска развития генетических отклонений у ребенка при вероятности наследственных патологий;
диагностирование обоих родителей при планировании беременности или тяжелом состоянии матери при протекающей беременности;
трудности с зачатием, выявление причин бесплодия;
подозрение на половые инфекции в острой стадии и при симптоматике перехода их в хроническую;
обнаружение причин воспалительных процессов неясного происхождения;
незащищенные случайные и постоянные половые контакты;
определение чувствительности патогенного микроорганизма к конкретным антибиотикам;
пациентам с подозрением на скрытую инфекцию для обнаружения патогенов до развития явной симптоматики (доклиническое диагностирование);
больным для подтверждения выздоровления после болезни (ретроспективная диагностика);:

Также используется диагностика при необходимости точного выявления следующих возбудителей::

вирусы гепатита (A B C G), иммунодефицита человека, цитомегаловирус;
вибрион холерный;
вирус простого герпеса, герпетиформные виды;
ретро – адено – и риновирусы;
вирусы краснухи, Эпштейна-Барр, варицелла (Зостер – вирус);
парво – и пикорновирусы;
бактерия Helicobacter pylori;
легионеллы, патогенные типы палочки кишечной;
стафилококк золотистый;
возбудитель ;
клостридии, дифтерийная и гемофильная палочка;

Используется и для определения инфекций:

инфекционный мононуклеоз;
боррелиоз, листериоз, клещевой энцефалит;
кандидоз, вызываемый грибками Candida;
половые инфекции – трихомониаз, уреаплазмоз, бледная трепонема, гарднереллез, гонорея, микоплазмоз, хламидиоз;
туберкулез.

Противопоказания для проведения

Поскольку процедура проводится не с пациентом, без какого-либо воздействия на организм, а с биологическим материалом, взятым для исследования, то никаких противопоказаний для ПЦР не имеется по причине отсутствия потенциальной опасности.

Однако забор биоматериала из шеечного канала матки не проводят после процедуры кольпоскопии. Сдача мазков, соскобов на анализ разрешена только через 4 – 6 дней после окончания менструации и полного прекращения выделений.

Безопасен ли метод

Никакое негативное влияние на пациента при изолированном исследовании его биоматериала в лабораторных условиях невозможно.

Подготовка к процедуре (сдача биологических веществ на анализ)

В качестве образца для анализа ПЦР, при котором выявляют ДНК чужеродного патогена, служит любая биологическая жидкость, ткань, выделения организма. Забор исследуемого вещества проводят в виде взятия крови из вены, соскоба из гортани, полости носа, мочеиспускательного канала, плевральной полости, шейки матки.

Перед диагностической процедурой врач объясняет пациенту, забор какого материала будет взят:

При обследовании на половые инфекции, производится забор выделений из половых органов, моча, мазок из уретры.
При анализе на герпетические инфекции, цитомегаловирус, мононуклеоз – берут на анализ мочу, мазок из зева, на гепатит, токсоплазмоз - кровь из вены.
С целью диагностирования различных видов проводится забор спинномозговой жидкости.
В пульмонологии образцы для анализа - мокрота и жидкость плевральная.
Когда проводят исследование возможных внутриутробных инфекций при вынашивании плода для анализа используют околоплодные воды и клетки плаценты.

Достоверность и точность анализа зависит от стерильности условий при взятии материала. Поскольку исследование ПЦР обладает высокой чувствительностью, любое загрязнение исследуемого вещества способно искажать результат.

Грамотная подготовка к сдаче биоматериала не представляет для пациентов никаких трудностей. Имеются определенные рекомендации:

при анализе на половые инфекции:
- исключить интимные контакты за 72 часа до сдачи материала;
- прекратить использование любых вагинальных средств за 3 суток;
- с вечера предыдущего дня не проводить гигиену исследуемой области;
- исключить мочеиспускание за 3 – 4 часа при взятии пробы из уретры;
прекратить прием антибиотиков за месяц до сдачи анализов на инфекции;
кровь сдают утром до принятия еды и питья;
сбор первой утренней порции мочи проводится в стерильный контейнер после тщательного интимного туалета.

О том, как проводится диагностика по методике полимеразной цепной реакции, читайте ниже.

Как проходит процедура

При выполнении исследования ПЦР раз за разом в реакторе (амплификаторе или термоциклере) повторяются определенные циклы:

Первый шаг – денатурация . Слюну, кровь, биоптат, гинекологические пробы, мокроту, в которых подозревается присутствие ДНК (или РНК) патогена, помещают в амплификатор, где происходит нагревание материала и расщепление ДНК на две отдельные цепочки.
Второй шаг – отжиг или небольшое охлаждение материала и добавление к нему праймеров, способных распознавать нужные участки в молекуле ДНК и связываться с ними.
Третий шаг – элонгация – происходит после присоединения 2 праймеров к каждой из цепочек ДНК. В ходе процесса фрагмент ДНК патогена достраивается, и формируется его копия.

Эти циклы повторяются по типу «цепной реакции», каждый раз приводя к удвоению копий специфичного фрагмента ДНК (например, отрезка, где запрограммирован определенный вирус). За несколько часов образуется множество копий фрагмента ДНК, и выявляется их присутствие в образце. После этого проводят анализ и сравнение результатов с данными базы различных видов патогенов, чтобы определить вид инфекции.

Про расшифровку результатов и вывод исходя из ПЦР-реакции читайте ниже.

Расшифровка результатов

Окончательный результат исследования выдается через 1 – 2 суток после сдачи биологического материала. Нередко – уже в первые сутки после анализа.

Качественный анализ

Отрицательный результат означает, что в веществе, сданном на исследование, следов возбудителей инфекции не обнаружено.
Положительный результат означает выявление патогенных вирусов или бактерий в биологическом образце с очень высокой степенью точности на момент сдачи материала.

Если результат положительный, но признаков активизации инфекции не выявлено – такое состояние организма называют бессимптомным «здоровым носительством». Чаще всего наблюдается при взятии биоматериала из определенного места (цервикальный канал, уретра, полость рта) при вирусных заболеваниях. Лечения в этом случае не требуется, но обязательно постоянное врачебное наблюдение, поскольку существует вероятность:

распространения вируса от носителей и заражение здоровых людей;
активизации процесса и переход заболевания в хроническую форму.

Однако - если положительным является анализ крови, это указывает на то, что инфекция поразила организм, и это уже не состояние носительства, а патология, требующая незамедлительной специфической терапии.

Количественный анализ

Количественный результат определяет специалист конкретно для определенного вида инфекции. На его основании можно оценить степень развития, стадию болезни, что дает возможность оперативно назначить правильное лечение.

Средняя стоимость

Цены на проведение полимеразной цепной реакции определяют: вид исследования, сложность идентификации возбудителя, трудность забора биологического материала, вид анализа (качественный или количественный), уровень цен в лаборатории.

С другой стороны, при исследовании ПЦР можно определить сразу несколько патогенов при заборе одного вида материала для анализа. Это позволяет сэкономить на других лабораторных анализах.

Ориентировочно, стоимость анализа ПЦР в рублях:

гонококк, гарднерелла, трихомонада вагиналис – от 180
хламидия трахоматис – от 190
папилломавирус – от 380 до 500
биоценоз урогенитального тракта у женщин (количественная и качественная оценка микрофлоры) – от 800.

Еще больше полезной информации в отношении исследования ПЦР содержится в видеосюжете ниже:

Генетика бактерий. Информация для второго занятия.

Полимеразная цепная реакция

Полимеразная цепная реакция – метод, позволяющий провести многократное увеличение (амплификацию) количества определенных молекул ДНК в анализируемом образце (в том числе в биологическом материале или чистой культуре).

Главные преимущества ПЦР как диагностического метода в микробиологии – очень высокая чувствительность, позволяющая обнаружение крайне малых концентраций возбудителей в образцах, а такжерегулируемая специфичность, позволяющая обнаруживать или идентифицировать возбудителей на родовом, видовом или субвидовом уровне. Основной недостаток ПЦР вытекает из его крайне высокой чувствительности – образы очень легко загрязнить ДНК из положительного контроля, другого образца или продукта ПЦР, что приведет к ложноположительной реакции. Это накладывает жесткие ограничения на условия, в которых производится смешивание ПЦР и работа с готовыми продуктами ПЦР.

Проведение ПЦР. Готовится реакционная смесь, содержащая следующие компоненты:

Выделенную ДНК из исследуемого образца,

Буферный раствор,

Ионы Mg2+ (необходимы для работы фермента),

Два праймера – одноцепочечныекороткие молекулы ДНК (длина чаще всегоот 18 до 24 нуклеотидов), комплементарные концам разных цепей обнаруживаемой последовательности ДНК.

Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов.

Термостойкую ДНК-полимеразу (чаще всего используется Taq-полимераза – полимераза, выделенная из Thermus aquaticus ).

Затем данная реакционная смесь помещается в амплификатор, который фактически представляет собой программируемый термостат. В амплификаторе проводится 30-40 циклов смены температур. Каждый из этих циклов состоит из трех этапов (см. Рис. 1):

Денатурация (температура 94 о С) – разрываются водородные цепи, и цепочки ДНК расходятся.

Отжиг праймеров (температура обычно в районе 50-60 о С) – к концам цепей ДНК присоединяются праймеры. Вообще, при снижении температуры энергетически выгоднее воссоединение исходных цепей ДНК из исследуемого образца (ренатурация), однако концентрация праймеров в реакционной смеси на много порядков больше концентрации ДНК из образца (по крайней мере, на начальных циклах ПЦР), поэтому реакция отжига праймеров протекает быстрее ренатурации ДНК. Температура отжига выбирается в зависимости от температур плавления (денатурации) праймеров.

Элонгация (температура обычно 72 о С) – ДНК-полимераза достраивает праймеры по матрице длинных цепей ДНК. Температура соответствует оптимальной температуре работы используемой ДНК-полимеразы.

Детекция результатов отличается в различных вариантах постановки ПЦР и описана в разделе «Разновидности ПЦР».

Динамика ПЦР

На ранних циклах ПЦР количество двухцепочечных молекул ДНК, размер которых определяется расстоянием между местами посадки праймеров, удваивается с каждым циклом. Также образуется малое количество более длинных молекул ДНК, которым можно пренебречь (см. Рис 2).

Таким образом, на ранних циклах количество продукта ПЦР описывается формулой m*2 n , где m – исходное количество искомой ДНК в пробе, n – число циклов. Затем реакция выходит на плато. Это происходит из-за накопления продукта реакции, снижения концентрации праймеров и дезоксинуклеотидтрифосфатов, а также за счет повышения концентрации пирофосфата (см. Рис 3).

Разновидности ПЦР

Конвенциональная ПЦР

В данном варианте постановки ПЦР реакция идет заранее выбранное число циклов (30-40), после чего анализируется, произошло ли накопление двуцепочечных молекул ДНК в реакционной смеси.

Данный вариант постановки ПЦР при использовании в качестве способа диагностики является качественным методом. Положительная реакция свидетельствует о наличии хотя бы следовых количеств искомых молекул ДНК в образце. Отрицательная реакция свидетельствует об их отсутствии. Количественная оценка содержания исходных молекул ДНК в образце невозможна из-за выхода реакции на плато.

Основным методом выявления наличия продукта является электрофорез в агарозном или полиакриламидном геле. Продукты ПЦР разделяются в геле под действием электрического поля в соответствии с их молекулярной массой. В гель добавляется интеркалирующий краситель (флуоресцирующий в связанном с двухцепочечной ДНК состоянии - чаще всего бромистый этидий). Таким образом, при облучении ультрафиолетом можно будет увидеть наличие или отсутствие полоски, соответствующей ДНК необходимой молекулярной массы. При проведении ПЦР в диагностических целях всегда ставятся положительный и отрицательный контроли реакции, с которыми сравниваются образцы (см. Рис. 4).

ПЦР в реальном времени

В данном варианте постановки ПЦР количество продукта ПЦР в реакционной смеси регистрируется постоянно в ходе протекания реакции. Это позволяет построить кривую протекания реакции (см. Рис. 3) и, исходя из неё, рассчитать количество искомых молекул ДНК в образцах.

Один из видов проведения ПЦР в реальном времени – с использованием интеркалирующегокрасителя, который добавляется прямо в реакционную смесь (чаще всего используется SYBRGreen). Другой вид – с использованием одного из видов флуоресцирующих зондов, связывающихся с участком внутри ПЦР-продукта, что позволяет повысить специфичность обнаружения (см. Рис 5).Детекцияфлуоресценции происходит непосредственно в приборе в ходе протекания реакции.

Помимо возможности количественного обнаружения, существуют и другие достоинства ПЦР в реальном времени по сравнению с конвенциональной. Данный вариант ПЦР более прост, быстр, а также не требует открывания пробирок с продуктами ПЦР, что уменьшает вероятность загрязнения других образцов. Основной недостаток – более высокая стоимость амплификатора со встроенной возможностью детекциифлуоресценции по сравнению с обычным.

Цифровая количественная ПЦР

Новый, дорогостоящий и пока малораспространенный вариант ПЦР, позволяющий более точно определять количество ДНК в образце.В данном варианте реакционная смесь, содержащая флуоресцентный краситель, разбивается на огромное число микроскопических объемов (например, капелек в эмульсии). После протекания ПЦР анализируется, в какой доле капелек реакция оказалась положительной и, соответственно, наблюдается флуоресценция. Эта доля будет пропорциональна числу искомых молекул ДНК в образце.

ПЦР с обратной транскрипцией

В данном случае перед тем или иным вариантом ПЦР производится реакция обратной транскрипции (РНК в ДНК) с использованием фермента ревертазы. Таким образом, этот метод позволяет проводить качественное или количественное обнаружение молекул РНК. Это может использоваться для детекции РНК-содержащих вирусов или определения уровня транскрипции (количества мРНК) того или иного гена.

Рисунок 1. Этапы ПЦР. Красным цветом обозначены праймеры.

Рисунок 2. Накопление двуцепочечных молекул ДНК, ограниченных праймерами, в ходе ПЦР.

Рисунок 3. Динамика реакции ПЦР при разных изначальных концентрациях искомых молекул ДНК в пробе. (а) – наибольшая концентрация (б) – промежуточная концентрация (в) – наименьшая концентрация

Рисунок 4. Агарозный электрофорез продуктов ПЦР. К+ – положительный контроль (заведомо присутствует искомая ДНК). 1-7 – исследуемые образцы (из них 1-2 – положительные, 3-7 – отрицательные). K- –отрицательный контроль (заведомо отсутствует искомая ДНК). Во многих случаях помимо целевого продукта видны более легкие неспецифические продукты реакции (праймер-димеры).

Рисунок 5. Способы детекции при использовании ПЦР в реальном времени. (а) – интеркалирующий краситель – флуоресцирует при связывании с двухцепочечной ДНК (б) – зонд Taqman – флуоресценция возникает при расщеплении зонда ДНК полимеразой с 5’-3’ эндонуклеазной активностью за счет разделения флуорофора и гасителя. (в) – зонд MolecularBeacon - флуоресценция возникает при гибридизации зонда с целевым фрагментом за счет пространственного отдаления флуорофора и гасителя (г) – зонды LightCycler - флуоресценция акцептора возникает при гибридизации зондов (содержащих акцептор и донор) с целевым фрагментом за счет резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET).

Проведение ПЦР-анализа (PCR diagnostics) начинается с забора материала для исследования врачом-гинекологом, урологом или дерматовенерологом. Качество, достоверность полученных впоследствии результатов обеспечивается высочайшей квалификацией и огромным опытом работы врачей медицинского центра «Евромедпрестиж» , соблюдающих все необходимые правила проведения ПЦР-анализа: полная стерильность, использование исключительно одноразовых материалов.

Забранный материал со щеточки помещают в контейнер с физраствором. После забора пробы как можно скорее должны быть доставлены в ПЦР — лабораторию.

Проведение в лаборатории ПЦР-анализа происходит в три этапа:

Выделение ДНК
Амплификация ДНК-фрагментов
Детекция ДНК-продуктов амплификации

Выделение ДНК — это первоначальный этап проведения ПЦР-диагностики, суть которого заключается в следующем: врач забирает у пациента материал для исследования и подвергает его специальной обработке. В процессе обработки происходит расщепление двойной спирали ДНК на отдельные нити. В материал пациента добавляется специальная жидкость, растворяющая органические вещества, мешающие «чистоте» проведения реакции. Таким образом удаляются липиды, аминокислоты, пептиды, углеводы, белки и полисахариды. В результате образуется ДНК или РНК.

Принцип метода ПЦР заключается в «строительстве» новых ДНК или РНК инфекций. Без удаления клеточного материала осуществить это невозможно.

Количество времени, затраченного на выделение ДНК, зависит от возбудителя инфекции и от вида используемого для исследования методом ПЦР материала. Например, для подготовки крови к следующему этапу требуется 1,5-2 часа.

0Array ( => Анализы) Array ( => 2) Array ( =>.html) 2

Амплификация ДНК

Для осуществления следующего этапа ДНК-диагностики — амплификации ДНК — врачи используют так называемые ДНК-матрицы — молекулы ДНК инфекций, на которые впоследствии будет происходить «клонирование» ДНК. Уже упоминалось, что наличие полной ДНК инфекции необязательно, для проведения этого этапа достаточно небольшого кусочка молекулы ДНК, который присущ только данному микробу (инфекции).

В основе амплификации ДНК и соответственно в основе всего принципа ПЦР-реакции лежит естественный для всего живого процесс достраивания ДНК — репликации ДНК, который осуществляется путем удвоения единичной цепочки ДНК.

Начав с одного-единственного фрагмента ДНК, врач-лаборант копирует его и увеличивает количество копий в режиме цепной реакции: после первого цикла у вас уже есть 2 фрагмента, после второго цикла — 4, после третьего — 8, после четвертого — 16, затем 32, 64, 128, 256... С каждым циклом происходит удвоение числа копий, и после двадцати циклов счет уже идет на миллионы, а после тридцати — на миллиарды. Цикл длится считанные минуты и сводится к определенному изменению температурного режима в очень небольшом химическом реакторе. Здесь в растворе в достаточном количестве находятся все нужные компоненты синтеза, прежде всего, нуклеотиды А, Г, Т и Ц, а также проведены тонкие подготовительные химические операции для того, чтобы с каждого готового отрезка ДНК тут же снималась точная копия, затем с этой копии — снова копия, в этом и состоит разветвленная цепная реакция.

Путем присоединения к цепи ДНК праймеров — искусственно синтезированных «кусочков» ДНК (нуклеотидных пар), аналогичных ДНК микробов (инфекции) — образуются две короткие, состоящие из двух цепей участков ДНК, спирали, необходимые для синтеза будущей ДНК.

Синтез новой цепи происходит путем достраивания каждой из двух нитей ДНК. Процесс амплификации происходит с помощью специфического участка — ДНК-полимеразы, давшему название лабораторному методу. Полимераза выступает в роли катализатора реакции и следит за последовательным прикреплением нуклеотидных оснований к растущей новой цепи ДНК.

Таким образом, амплификация ДНК представляет собой многократное увеличение числа копий ДНК, которые специфичны, т. е. присущи только определенному организму. Нет необходимости достраивать всю цепь ДНК, чтобы увидеть возбудителя инфекции. Нужен только тот участок, который характерен для данной бактерии как для индивидуальности.

5360 руб.Стоимость комплексной программы у врача гастроэнтеролога

СКИДКА 25%НА ПРИЕМ ВРАЧА КАРДИОЛОГА

- 25%первичный
приём врача
терапевта по выходным

5 160 руб.вместо 5 420 руб. Обследование мужчин на урологические инфекции

АЛЛЕРГОЛОГИЯ5 120 руб. вместо 5 590 руб.

Все многочисленно повторяющиеся этапы амплификации происходят при различных температурах. Для проведения ПЦР-анализа используется специально программируемое оборудование — ПЦР — термостат или амплификатор, которое автоматически осуществляет смену температур. Амплификация проводится по заданной программе, соответствующей виду определяемой инфекции. В зависимости от программы и вида определяемой инфекции процесс автоматизированной ПЦР занимает от 2 до 3 часов.

Важное значение в ПЦР-диагностике играет квалификация врача-лаборанта, проводящего анализ, от него зависит правильность настройки ПЦР-оборудования и интерпретация полученных результатов. Врачи медицинского центра «Евромедпрестиж» имеют большой опыт в проведении ДНК-диагностики, что обеспечивает достоверность полученных результатов исследования и гарантирует положительный успех в лечении инфекционных заболеваний. Чтобы сдать анализы методом ПЦР и провести полную диагностику и лечение инфекционных заболеваний в нашем медицинском центре «Евромедпрестиж».

В процессе детекции продуктов амплификации проходит разделение полученной смеси продуктов амплификации. К смеси добавляется специальные растворы, которые наделяют фрагменты ДНК способностью флуоресцировать — отражаться оранжево-красными светящимися полосами. Образующееся свечение выдает присутствие ДНК вирусов, микробов или бактерий в забранном у пациента на ПЦР-анализ материале.

Разделы