Организация приёма, маркировки и регистрации биоматериала. Способы взятия биоматериала для исследований методом пцр Инструкция по приему и регистрации биоматериала

Отбор клинического материала осуществляет медицинский персонал с соблюдением правил противоэпидемического режима, только стерильными одноразовыми инструментариями (шприцы, соответствующие зонды, цитощеточки и пр.), в одноразовых перчатках.

Максимально полно собрать материал из выбранного локуса, используя подходящие для этого аппликаторы – зонды, цитощетки (обеспечить адекватность клинического образца).

Сохранить полученный материал (ДНК/РНК микроорганизмов), используя надежные транспортные среды и консерванты, предоставляемые ПЦР-лабораторией. Среда для транспортировки и хранения клинического материала обеспечивает стабильность РНК и ДНК при комнатной температуре до 28 дней.

Поместить взятый материал в вакуэты с ЭДТА (кровь), в одноразовые химически чистые пробирки «Эппендорф» (мазки, ликвор, биоптат и др.). Основным условием при сборе материала является предотвращение попадания в пробу ДНК-аз и рибонуклеаз, т.к. рибонуклеазы и ДНК-азы – ферменты деградации РНК и ДНК. Они чрезвычайно стабильны в окружающей среде, выдерживают длительное кипячение. Основной источник нуклеаз – кожные покровы, частицы пыли. Пластиковые пробирки и наконечники должны иметь маркировку «DNase, RNase- free» (свободные от нуклеаз).

Сразу после забора плотно закрывать пробирки, флаконы с клиническим материалом, не касаясь их внутренней поверхности и внутренней поверхности крышек.

При работе с клиническим материалом, открывая пробирки, флаконы, не производить резких движений и не допускать разбрызгивания и расплескивания, что может привести к контаминации проб и рабочих поверхностей.

Для исключения взаимной контаминации образцы хранить и транспортировать в отдельном полиэтиленовом пакете или штативах. При необходимости переноса образца использовать автоматические микропипетки со сменными одноразовыми наконечниками с аэрозольными барьерами.

До транспортировки в ПЦР-лабораторию отобранный биоматериал хранить при температуре 2–4 °С не более 48 часов. Необходимо минимизировать время от забора образца до постановки ПЦР-анализа. Транспортировка образцов осуществляется в сумках-холодильниках, термоконтейнерах, термосах с термопакетами, льдом или сухим льдом.

Кровь, плазма, сыворотка

Забор крови рекомендуется проводить с использованием вакуумных систем. Внедрение таких систем позволяет стандартизировать манипуляции с кровью, положительно сказывается на всех этапах лабораторного исследования и в целом переводит работу лаборатории на иной, более высокий уровень качества. Их использование гарантирует защиту персонала от инфицирования, сокращается время, затрачиваемое на процедуру забора крови, значительно реже сопровождается гемолизом, позволяет сохранить стерильность проб крови и герметично транспортировать.

Венепункцию рекомендуется выполнять натощак из локтевой вены в специальную вакуумную пробирку с антикоагулянтом, после чего пробирка переворачивается для перемешивания несколько раз. Пробирки с кровью хранят в холодильнике при +4 °С – +8 °С. Максимальный срок хранения крови – 1 сутки (не замораживать!). В случае необходимости длительного хранения необходимо отобрать 1 мл сыворотки или плазмы крови и хранить ее при температуре -16 о -20 о С не более 2 недель.

Характеристика вакуумных систем, используемых для ПЦР-диагностики:

Вакуэты с ЭДТА (6 %) – используются для проведения качественных и количественных исследований. ЭДТА-антикоагулянт хорошо фиксирует нуклеиновые кислоты клетки.

Вакуэты с цитратом натрия (3,8 %) – используются для проведения качественных и количественных исследований. Не подходят для длительной транспортировки, т.к. цитрат является хорошей питательной средой для посторонней микрофлоры.

Вакуэты без антикоагулянтов (сыворотка крови) – используются для проведения качественных исследований. Использования сыворотки крови для количественных исследований нежелательно, т.к. часть инфекционного агента оседает в сгустке крови, при этом снижается возможность определения количественного содержания его в крови.

Вакуэты с гепарином - категорически не подходят для ПЦР - реакции. Гепарин является полианионом, как и ДНК, поэтому в ПЦР-реакции конкурирует с ДНК.

Инструкция по сбору, хранению и транспортировке

биологического материала для лабораторных исследований

для выявления возбудителей заболеваний методом ПЦР

1.1.1. Взятие биоматериала производится из предполагаемого места обитания микроорганизмов и развития инфекции.

1.1.2. Количество забранного материала должно быть небольшим. Избыток отделяемого, слизь и гной отрицательно влияют на качество выделения ДНК и способствуют деградации ДНК при хранении и транспортировке.

1.1.3. При внесении биоматериала, взятого у пациента зондом с ватным тампоном или щеточкой, в пробирку типа эппендорф с буферным раствором, необходимо:

Соблюдать стерильность;

Прежде, чем погружать собранный на тампоне (щеточке) биоматериал в раствор, размазать его по сухой стенке пробирки, затем смочить тампон (щеточку) в растворе и, вращая зонд, тщательно смыть весь материал со стенки пробирки и тампона (щеточки);

По возможности отжать тампон о стенку пробирки, удалить зонд с тампоном (щеточкой) и закрыть пробирку.

1.2. Способы взятия биоматериала для исследований методом ПЦР

1.2.1. Соскобы. Для соскобов используются одноразовые стерильные зонды, имеющие ватный тампон с повышенной адсорбцией или «щеточки», реже - ложки Фолькмана, малые ушные ложки или аналогичные инструменты со слегка затупленными краями. Поскабливающими движениями собрать материал. Исследуемый материал должен содержать возможно большее количество эпителиальных клеток и минимальное количество слизи, примесей крови и экссудата. Внести материал в стерильную пробирку типа эппендорф с буферным раствором (см. раздел 1.1.).

Соскоб из цервикального канала: перед взятием соскоба необходимо удалить избыток слизи стерильным ватным тампоном, обработать шейку матки стерильным физиологическим раствором. Зонд ввести в цервикальный канал на глубину 0,5-1,5 см, избегая соприкосновения со стенками влагалища, и поскабливающим движением (не до крови) собрать материал. Небольшое количество эритроцитов в пробе не влияет на результат анализа. При наличии эрозии шейки матки материал берут с границы здоровой и измененной ткани.

Соскоб из уретры: зонд ввести в уретру (у мужчин - на глубину 2-4 см) и несколькими вращательными движениями собрать материал. Накануне перед взятием материала допускается провокация (острая пища, алкоголь и др.). Рекомендуется воздержаться от мочеиспускания в течение 1-2-х часов перед взятием пробы. При наличии обильных гнойных выделений соскоб надо брать не позже, чем через 15 минут после мочеиспускания.

Соскоб с конъюнктивы берут, предварительно проведя анестезию глаза 0,5% раствором дикаина. Вывернув веко, зондом с ватным тампоном (либо глазным скальпелем) собрать эпителиальные клетки с конъюнктивы.

Соскоб из прямой кишки: зонд ввести в анальное отверстие на глубину 3-4 см и вращательным движением собрать материал.

1.2.2. Мазки. Одноразовым стерильным зондом с ватным тампоном или щеточкой взять небольшое количество отделяемого (со сводов влагалища, из зева, носоглотки и др.) и перенести в стерильную пробирку типа эппендорф с буферным раствором (см. раздел 1.1.).

1.2.3. Кровь. Для исследований методом ПЦР кровь должна быть нативной (не свернувшейся).

Кровь собрать асептически, путем венопункции - в фирменную пробирку (2-3 мл) с антикоагулянтом ЭДТА (гепарин в качестве антикоагулянта использовать нельзя! ), аккуратно перемешать, плавно переворачивая пробирку.

Кровь с ЭДТА является биоматериалом для следующих групп исследований:

- генетические исследования (момент забора крови значения не имеет).

- выявление возбудителей инфекций (наиболее информативными являются пробы, взятые при ознобе, повышенной температуре, т. е. предположительно во время виремии или бактериемии).

1.2.4. Моча. В пустой стерильный контейнер с плотно завинчивающейся крышкой собирают утреннюю первую или среднюю порцию мочи в количестве минимум 10 мл. Если забор мочи проводят днем, то перед этим пациент не должен мочиться 1,5-3 часа.

1.2.5. Мокрота. Утром провести санацию ротовой полости и горла (прополоскать раствором питьевой соды). Собрать мокроту в пустой стерильный широкогорлый флакон.

1.2.6. Биоптат. Взятие материала осуществлять из зоны предполагаемого местонахождения возбудителя инфекции, из поврежденной ткани или пограничного с повреждением участка. Поместить биоптат в стерильную пробирку типа эппендорф с буферным раствором.

1.2.7. Слюна, желудочный сок, ликвор, синовиальная жидкость. Слюна (1-5 мл), желудочный сок (1-5 мл), ликвор (1-1,5 мл) - поместить в пустую стерильную пробирку (контейнер).

1.2.8. Сок предстательной железы. После массажа предстательной железы сок собирают в количестве 0,5-1 мл в пустую стерильную пробирку (контейнер). При невозможности получить сок, сразу после массажа собирают первую порцию мочи в количестве не более 10 мл (в этой порции содержится сок предстательной железы).

1.2.9. Смывы, бронхоальвеолярный лаваж (БАЛ). Стерильным ватным тампоном и 5-7 мл физиологического раствора проводят смыв, например, с наконечника эндоскопа или бронхоскопа, и помещают 0,5-5 мл смыва в пустую стерильную пробирку (контейнер).

1.2.10. Фекалии. Зонд с ватным тампоном помещают внутрь каловых масс и слегка проворачивают, захватывая небольшое количество материала. Затем материал помещают в стерильную пробирку типа эппендорф с буферным раствором.

1.3. Правила хранения биологического материала для исследований методом ПЦР

1.3.1. Мазки, соскобы :

В холодильной камере (+4ºС - +8ºС) до 7-и суток;

В морозильной камере (-20ºС) до 14 суток (допускается только однократное размораживание!).

1.3.2. Моча : в холодильной камере (+4ºС - +8ºС) не более 1-х суток;

1.3.3. Кровь с ЭДТА : в холодильной камере (+4ºС - +8ºС) - для определения возбудителей инфекций - не более 1-х суток; для генетических исследований – до 4-х суток. Замораживанию не подлежит.

1.3.4. Мокрота

1.3.5. Биоптаты :

В холодильной камере (+4ºС - +8ºС) не более 1-х суток,

В морозильной камере (-20ºС) до 2-х недель.

1.3.6. Сок предстательной железы : в холодильной камере (+4ºС - +8ºС) не более 1-х суток.

1.3.7. Синовиальная жидкость : в холодильной камере (+4ºС - +8ºС) не более 1-х суток.

2. Правила взятия, хранения и транспортировки крови

для иммунохимических исследований

2.1.1. Накануне взятия крови исключить физические нагрузки, стрессовые ситуации, физиотерапевтические процедуры, прием лекарственных средств (за исключением случаев медикаментозного лечения по назначению врача), оральных контрацептивов, прием спиртных напитков и жирной пищи. Непосредственно перед исследованием не курить.

2.1.2. При исследовании функции щитовидной железы в период лечения препаратами, содержащими гормоны ЩЖ, исследование проводится через 24 ч. после последнего приема препарата; за 2-3 дня до взятия крови исключить прием препаратов, содержащих йод.

2.1.3. При исследовании ПСА за неделю до анализа исключить любые манипуляции с предстательной железой.

2.1.4. Взятие крови производят утром, натощак (во избежание хилёзности, т. е. мутности сыворотки), в условиях физиологического покоя. Перед забором крови пациенту необходимо предоставить 15-минутный отдых.

2.1.5. Взятие крови осуществляют в процедурном кабинете ЛПУ, в положении пациента «сидя» или «лёжа», из локтевой вены с соблюдением правил асептики и антисептики . Кровь собирают в стерильную пробирку, шприц-моновет или cистему для взятия крови (Vacutainer®, Vacuette®).

2.1.6. Для получения сыворотки венозная кровь отстаивается до полного свертывания. После образования фибринового сгустка последний отделяют от стенок стерильной стеклянной палочкой, строго индивидуальной для каждой пробы, пробирку центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин* .

* Шприц-моновет и cистемы для взятия крови (Vacutainer®, Vacuette®) подвергаются центрифугированию без предварительных манипуляций.

2.1.7. Надосадочную жидкость желтого цвета (сыворотку) осторожно переносят пипеткой в пустую пробирку с крышкой (на 5 мл).

2.2. Правила хранения крови и сыворотки крови для иммунохимических исследований

2.2.1. К ровь: в холодильной камере (+40С - +80С) в течение 1-х суток.

2.2.2. Сыворотка крови:

В холодильной камере при температуре +40С - + 80С в течение 4-х суток;

В морозильной камере при температуре -200С в течение 2-х недель.

Допускается только однократное размораживание!

ВНИМАНИЕ! Исследованию подлежит сыворотка, не содержащая примеси эритроцитов, бактериальных проростов, хилёза, гемолиза. При наличии любого из указанных признаков сыворотка уничтожается и назначается повторное взятие крови.

2.3. Правила взятия и хранения крови для исследования волчаночного антикоагулянта

и коагулогических исследований

2.3.1. Взятие крови производится утром натощак из локтевой вены с соблюдением правил асептики и антисептики в день выполнения исследования. Для предотвращения активации свертывания крови компрессия вены не должна превышать 1 минуту.

2.3.2. Если исследование назначается на фоне приема препаратов, влияющих на свертывание крови, необходимо отметить это в направлении.

2.3.3. Кровь собирают в специальную пробирку, содержащую цитрат натрия , до отметки. При несоблюдении этого правила изменяется соотношение кровь/антикоагулянт, что может отрицательно сказаться на точности результата.

2.3.4. В течение 1 ч. после взятия крови пробирку необходимо отцентрифугировать при 3000 об/мин в течение 15 минут.

2.3.5. Хранение плазмы: до 6 часов при температуре +40С - +80С или до 2-х недель при температуре -200С.

2.4. Правила взятия и хранения крови для исследования гликированного (гликозилированного) гемоглобина

2.4.1. Взятие крови производится утром натощак из локтевой вены, соблюдая правила асептики и антисептики.

2.4.2. Кровь собирают в специальную пробирку, содержащую ЭДТА, плавно перемешивают. Не центрифугировать!

2.4.3. Доставка в Лабораторию в день взятия крови.

2.4.4. Хранение: до 2-х недель при температуре -200С.

2.5. Правила проведения пренатального скрининга

2.5.1. Оптимальные сроки проведения исследования: I триместр – 10-13 недель беременности; II триместр – 16-18 недель беременности.

2.5.2. При направлении на исследование заполняется специальное направление, в котором необходимо указать индивидуальные данные беременной женщины: возраст (число/месяц/год), вес, результаты УЗИ (КТР, БПР, количество плодов, срок беременности по УЗИ (недели+дни); если имеются - данные о величине шейной складки - NT) с обязательным указанием даты УЗИ и ФИО врача, проводившего УЗИ; наличие дополнительных факторов риска (курение, сахарный диабет, ЭКО), этническая принадлежность.

2.5.3. Для скрининга II триместра беременности можно использовать данные УЗИ, проведенного в I триместре.

3. Правила взятия, хранения и транспортировки биоматериала

для бактериологических исследований

3.1. Взятие биоматериала производят до применения курса антибактериальной терапии или не менее, чем через неделю после ее завершения.

3.2. Для предупреждения контаминации пробы микроорганизмами из внешней среды взятый биоматериал переносят в пустой контейнер или пробирку с транспортной средой с соблюдением стандартных правил стерильности: пробка пробирки (контейнера) открывается/закрывается так, чтобы внутренняя часть пробки осталась стерильной, стерильная посуда открытой держится недолго.

3.3. Взятие биоматериала для выявления микоплазм и уреаплазм, трихомонад, гонококков, неспецифической микрофлоры , культур анаэробных бактерий производится в фирменные пробирки с угольной транспортной средой:

Упаковку открыть в указанном месте согласно схеме;

Пробирку вынуть и открыть, крышку выбросить;

Зондом взять соскоб/мазок, биоптат или обмакнуть зонд в биологическую жидкость;

Зонд с биоматериалом сразу поместить в пробирку (ручка зонда является крышкой пробирки);

Пробирку пронумеровать, номер указать в направлении.

3.4. Виды биологического материала для взятия в транспортную угольную среду: мазки/соскобы, сок предстательной железы, ликвор, синовиальная жидкость, биоптат.

3.5. Хранение биоматериала в пробирках с транспортной средой для выявления микоплазм и уреаплазм, неспецифической микрофлоры до момента транспортировки -

Доставка в Лабораторию в течение одних суток.

3.6. Хранение биоматериала в пробирках с транспортной средой для выявления трихомонад, гонококков, культур анаэробных бактерий до момента транспортировки - при комнатной температуре.

3.7. Нативный биоматериал: мокроту, сок предстательной железы, синовиальную жидкость от 1 до 10 мл для выявления неспецифической микрофлоры, микоплазм и уреаплазм собирают в пустой стерильный контейнер.

Необходимо оповестить Лабораторию накануне или в день взятия биоматериала до 11:00.

Хранение нативного биоматериала до момента транспортировки - в холодильной камере (+4ºС - +8ºС).

Доставка в Лабораторию в день взятия материала.

3.8. Мочу для исследования на степень бактериурии (утренняя средняя порция, 10-20 мл) собирают в пустой стерильный контейнер с крышкой после тщательного туалета наружных половых органов.

Необходимо оповестить Лабораторию накануне или в день взятия биоматериала до 11:00.

Хранение биоматериала до момента транспортировки - в холодильной камере (+4ºС - +8ºС).

Доставка в Лабораторию в день взятия биоматериала.

3.9. Кровь на стерильность .

Наиболее информативной является проба крови, взятая во время подъема температуры.

Кровь собирают в фирменные флаконы с двухфазной транспортной средой (флакон для взрослых, флакон для детей). Пластмассовую крышку флакона аккуратно вскрыть, появившуюся часть резиновой пробки протереть 70%-м спиртом. В стерильных условиях шприцем взять кровь из вены и ввести через резиновую пробку во флакон (4 мл - во флакон для взрослых, 2 мл - во флакон для детей).

Необходимо оповестить Лабораторию накануне или в день взятия биоматериала до 11:00.

Хранение крови до момента транспортировки - при комнатной температуре.

Доставка в Лабораторию в день взятия биоматериала.

3.10. Грудное молоко для выявления неспецифической микрофлоры берется из каждой груди в отдельный стерильный герметично закрывающийся стаканчик. Подписать стаканчики: «левая грудь», «правая грудь».

Перед сбором биоматериала грудь помыть теплой водой с мылом, вытереть чистым полотенцем, тщательно обработать соски и околососковую область ватным тампоном, смоченным 70% раствором этилового спирта, просушить стерильной салфеткой (каждая железа обрабатывается отдельным тампоном). Первые 10-15 мл сцеженного молока для анализа не используются. Вторую порцию молока из каждой груди сцедить в подписанный стаканчик в количестве ~ 10 мл.

Необходимо оповестить Лабораторию накануне или в день взятия биоматериала до 11:00.

Доставка в Лабораторию в течение 2-х часов в день взятия материала.

3.11. Кал на дисбактериоз .

Перед взятием пробы запрещается употребление алкоголя в течение 3-х суток и прием антибиотиков в течение 2-х недель. Стул необходимо получить без клизм и слабительных. Детям при запорах можно использовать для раздражающего эффекта кусочек мыла. Фекалии собирают в индивидуальное судно, отмытое от дезинфектанта. Стерильной ложкой отбирают 3-5 г средней порции кала и помещают в стерильный контейнер.

Необходимо оповестить Лабораторию накануне или в день взятия биоматериала до 11:00.

Хранение до момента транспортировки - контейнер с биоматериалом для сохранения тепла хранить обернутым в вату и бумагу.

Доставка в Лабораторию в день взятия биоматериала.

4. Правила взятия, хранения и транспортировки биоматериала

для микроскопических исследований

4.1. От каждого пациента - 2 стекла (одно стекло – запасное). На каждом стекле - 3 точки: влагалище (V ), цервикальный канал (С ), уретра (U ). Наносить мазки так, чтобы матовая поверхность была слева, сверху, и от нее – слева направо: v, c, u.

4.2. Маркировка (№) на стекле не должна растворяться в спирте (можно подписывать на матовой части стекла простым карандашом). Мазки должны быть зафиксированы посредством высушивания на воздухе (30-60 мин).

4.3. Стекла должны быть промаркированы, сложены мазками друг к другу, упакованы в индивидуальный пакет с соответствующей сопроводительной надписью (ЛПУ, Ф. И.О. пациента, № на стекле).

4.4. Пакет и заполненное направление передаются в Лабораторию.

5. Правила взятия, хранения и транспортировки биоматериала

5.1. В течение 24-х часов перед исследованием необходимо исключить спринцевание, применение интравагинальной терапии и половые контакты. Нельзя брать материал во время менструации. Наиболее информативными являются пробы, взятые на 14-20 дни после начала менструации.

5.2. Материал берется до бимануального исследования, проведения различных диагностических проб, до взятия материала на ПЦР. Взятие материала осуществляется без предварительной обработки слизистой влагалища.

5.3. Соскоб со слизистой влагалища/цервикального канала берется нейлоновой щеточкой Cervex-Brush, шпателем или другим инструментом и равномерно распределяется по стеклу, оставляя один конец стекла чистым (для маркировки). На стекло берется одна точка, дублируется еще на одно запасное стекло (всего два стекла на одну точку). Мазки должны быть зафиксированы посредством высушивания на воздухе (30-60 мин).

5.4. Стекла должны быть промаркированы (№ и Ф. И.О. пациента), сложены мазками друг к другу, упакованы в индивидуальный пакет с соответствующей сопроводительной надписью (ЛПУ, Ф. И.О. пациента, № на стекле).

5.5. Хранить высушенные мазки можно до 6 дней при комнатной температуре.

5.6. Пакет и заполненное направление (на каждую точку свое направление с указанием вида биоматериала) передаются в Лабораторию.

Не вкладывать направление в пакет со стеклами, не заворачивать стекла в направление!

Правила взятия, хранения и транспортировки биоматериала

Для выявления возбудителей заболеваний методом ПЦР

1.1.1. Взятие биоматериала производится из предполагаемого места обитания микроорганизмов и развития инфекции.

1.1.2. Количество забранного материала должно быть небольшим. Избыток отделяемого, слизь и гной отрицательно влияют на качество выделения ДНК и способствуют деградации ДНК при хранении и транспортировке.

1.1.3. При внесении биоматериала, взятого у пациента зондом с ватным тампоном или щеточкой, в пробирку типа эппендорф с буферным раствором, необходимо:

Соблюдать стерильность;

Прежде, чем погружать собранный на тампоне (щеточке) биоматериал в раствор, размазать его по сухой стенке пробирки, затем смочить тампон (щеточку) в растворе и, вращая зонд, тщательно смыть весь материал со стенки пробирки и тампона (щеточки);

По возможности отжать тампон о стенку пробирки, удалить зонд с тампоном (щеточкой) и закрыть пробирку.

Способы взятия биоматериала для исследований методом ПЦР

1.2.1. Соскобы. Для соскобов используются одноразовые стерильные зонды, имеющие ватный тампон с повышенной адсорбцией или «щеточки», реже - ложки Фолькмана, малые ушные ложки или аналогичные инструменты со слегка затупленными краями. Поскабливающими движениями собрать материал. Исследуемый материал должен содержать возможно большее количество эпителиальных клеток и минимальное количество слизи, примесей крови и экссудата. Внести материал в стерильную пробирку типа эппендорф с буферным раствором (см. раздел 1.1.).

Соскоб из цервикального канала: перед взятием соскоба необходимо удалить избыток слизи стерильным ватным тампоном, обработать шейку матки стерильным физиологическим раствором. Зонд ввести в цервикальный канал на глубину 0,5-1,5 см, избегая соприкосновения со стенками влагалища, и поскабливающим движением (не до крови) собрать материал. Небольшое количество эритроцитов в пробе не влияет на результат анализа. При наличии эрозии шейки матки материал берут с границы здоровой и измененной ткани.

Соскоб из уретры: зонд ввести в уретру (у мужчин - на глубину 2-4 см) и несколькими вращательными движениямисобрать материал. Накануне перед взятием материала допускается провокация (острая пища, алкоголь и др.). Рекомендуется воздержаться от мочеиспускания в течение 1-2-х часов перед взятием пробы. При наличии обильных гнойных выделений соскоб надо брать не позже, чем через 15 минут после мочеиспускания.

Соскоб с конъюнктивы берут, предварительно проведя анестезию глаза 0,5% раствором дикаина. Вывернув веко, зондом с ватным тампоном (либо глазным скальпелем) собрать эпителиальные клетки с конъюнктивы.

Соскоб из прямой кишки: зонд ввести в анальное отверстие на глубину 3-4 см и вращательным движением собрать материал.

1.2.2. Мазки. Одноразовым стерильным зондом с ватным тампоном или щеточкой взять небольшое количество отделяемого (со сводов влагалища, из зева, носоглотки и др.) и перенести в стерильную пробирку типа эппендорф с буферным раствором (см. раздел 1.1.).

1.2.3. Кровь. Для исследований методом ПЦР кровь должна быть нативной (не свернувшейся).

Кровь собрать асептически, путем венопункции - в фирменную пробирку (2-3 мл) с антикоагулянтом ЭДТА (гепарин в качестве антикоагулянта использовать нельзя! ), аккуратно перемешать, плавно переворачивая пробирку.

Кровь с ЭДТА является биоматериалом для следующих групп исследований:

- генетические исследования (момент забора крови значения не имеет).

- выявление возбудителей инфекций (наиболее информативными являются пробы, взятые при ознобе, повышенной температуре, т. е. предположительно во время виремии или бактериемии).

1.2.4. Моча. В пустой стерильный контейнер с плотно завинчивающейся крышкой собирают утреннюю первую или среднюю порцию мочи в количестве минимум 10 мл. Если забор мочи проводят днем, то перед этим пациент не должен мочиться 1,5-3 часа.

1.2.5. Мокрота. Утром провести санацию ротовой полости и горла (прополоскать раствором питьевой соды). Собрать мокроту в пустой стерильный широкогорлый флакон.

1.2.6. Биоптат. Взятие материала осуществлять из зоны предполагаемого местонахождения возбудителя инфекции, из поврежденной ткани или пограничного с повреждением участка. Поместить биоптат в стерильную пробирку типа эппендорф с буферным раствором.

1.2.7. Слюна, желудочный сок, ликвор, синовиальная жидкость. Слюна (1-5 мл), желудочный сок (1-5 мл), ликвор (1-1,5 мл) - поместить в пустую стерильную пробирку (контейнер).

1.2.8. Сок предстательной железы. После массажа предстательной железы сок собирают в количестве 0,5-1 мл в пустую стерильную пробирку (контейнер). При невозможности получить сок, сразу после массажа собирают первую порцию мочи в количестве не более 10 мл (в этой порции содержится сок предстательной железы).

1.2.9. Смывы, бронхоальвеолярный лаваж (БАЛ). Стерильным ватным тампоном и 5-7 мл физиологического раствора проводят смыв, например, с наконечника эндоскопа или бронхоскопа, и помещают 0,5-5 мл смыва в пустую стерильную пробирку (контейнер).

1.2.10. Фекалии. Зонд с ватным тампоном помещают внутрь каловых масс и слегка проворачивают, захватывая небольшое количество материала. Затем материал помещают в стерильную пробирку типа эппендорф с буферным раствором.

Чаще всего на ПЦР отправляют соскобы со слизистой половых путей, и этот анализ является самым точным из всех имеющихся на сегодняшний день средств диагностики ЗППП. Редко приходится делать ПЦР крови, мочи, слюны и других биологических жидкостей.

Техника исполнения анализа

Под действием определенных реактивов ДНК бактерий в материале, отправленном на анализ, увеличивается во много раз и становится различимой и идентифицируемой для приборов.

Значение результатов анализа

ПЦР всегда качественный анализ, то есть ответом может быть только “обнаружено” или “не обнаружено”. Расшифруем, что кроется за этими значениями. “Обнаружено”, или “положительно”, или просто “+” – из исследуемого материла выделена ДНК соответствующей бактерии, и с вероятностью 97% можно сказать, что человек заражен этой инфекцией. “Не обнаружено”, “отрицательно”, “-” – из исследуемого материала ДНК соответствующей бактерии не выделено, с вероятностью 97% можно утверждать, что большого количества этих бактерий в организме пациента нет, с вероятностью 60% – что пациент не заражен этой инфекцией.

Для того, чтобы бактерия попала в пробирку с материалом, отправляемым на анализ, необходимо, чтобы она содержалась в организме человека в определенном количестве. Если количество бактерий в организме человека минимально, они почти наверняка в пробирку не попадут, и результат анализа придет отрицательный. Однако человек при этом все равно инфицирован и болен. Поэтому для максимального увеличения точности результата перед проведением ПЦР-диагностики требуется специальная подготовка.

ВЫСОКАЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ И СПЕЦИФИЧНОСТЬ

ПЦР – метод молекулярной диагностики, ставший для ряда инфекций “золотым стандартом”, проверен временем и тщательно апробирован клинически.

Необычайная чувствительность метода позволяет нашим специалистам гарантированно обнаруживать единичные возбудители в биологическом материале на основе их генетической информации. Аналитическая чувствительность АмплиСенс ПЦР-тест-систем для большинства вирусов и бактерий – воспроизводимое выявление 100 микроорганизмов в исследуемой биологической пробе (1000 МИКРООРГАНИЗМОВ В 1 МЛ)

Специфичность ПЦР при использовании технологии АмплиСенс даже для всех вирусных, хламидийных, микоплазменных, уреаплазменных и большинства других бактериальных инфекций достигает 100%.

Забор биологического материала для лабораторных исследований методом ПЦР

Забор крови производится натощак из локтевой вены одноразовой иглой (диаметр 0,8-1,1 мм) в одноразовый шприц объемом 5 мл или специальную вакуумную систему типа “Venoject” (с ЭДТА). При заборе в шприц кровь из него аккуратно (без образования пены) переносится в одноразовую пробирку с антикоагулянтом (6% раствор ЭДТА в соотношении 1:19 или 3,8% раствор цитрата Na в соотношении 1:9. Гепарин в качестве антикоагулянта использовать нельзя), пробирка закрывается пробкой и переворачивается несколько раз (для перемешивания с антикоагулянтом). Пробирка с кровью до исследования хранят в холодильнике при +4°С – +8°С.

Максимальный срок хранения:

При исследовании на вирусные гепатиты – 2 суток

При исследовании на другие инфекции – 5 часов

Для анализа отбирается первая порция утренней мочи в количестве 10 мл в специальный флакон или пробирку без консервирующего раствора.

Максимальный срок хранения отобранного материала 1 сутки в холодильнике при температуре +4°С.

Перед забором слюна производится трехкратное полоскание полости рта физиологическим раствором. Забор слюны производится в одноразовые пробирки в количестве 3-5 мл.

Материал необходимо отбирать непосредственно перед исследованием или немедленно доставлять в лабораторию. При невозможности быстрой доставки материал замораживают при –20 °С. Последующая транспортировка осуществляется в замороженном состоянии (в термосе со льдом).

Мазок из ротоглотки

Забор материала производится рабочей частью стерильного одноразового аппликатора с задней стенки глотки и крипт миндалин. После забора материала аппикатор помещают в стерильную одноразовую пробирку.

Мокрота и плевральный выпот

Материал отбирают в специальные флаконы в количестве 5-10 мл.

Максимальный срок хранения материала 1 сутки в холодильнике при температуре +4°С – +8°С.

Биопсийный материал

Биопсийный материал помещают сухую одноразовую пробирку типа “Эппендорф”.

Максимальный срок хранения материала 1 сутки в холодильнике при температуре +4°С – +8°С.

Синовиальная жидкость

Забор материала производится одноразовым шприцом в количестве 1 мл. Отобранный материал помещают в сухую одноразовую пробирку типа “Эппендорф”.

Максимальный срок хранения материала 1 сутки в холодильнике при температуре +4°С – +8°С.

Забор материала для анализа на урогенитальные инфекции

Забор материала у женщин:

Соскоб производится из трех различных точек:

цервикальный канал

задний свод влагалища

При необходимости материал для исследования берется из генитальных язв (исследование на HSV-II, Haemophilus ducrei).

Забор производится универсальным зондом или ложкой Фолькмана. Если соскоб взят универсальным зондом, рабочая часть зонда, содержащая исследуемый материал, отрезается или обламывается и помещается в одноразовую пробирку типа “Эппендорф” с консервирующим раствором. Если забор производится ложкой Фолькмана, рабочая часть инструмента споласкивается в консервирующем растворе, содержащемся в одноразовой пробирке типа “Эппендорф”.

Максимальный срок хранения материала 1 сутки в холодильнике при температуре +4°С – +8°С.

Забор материала у мужчин:

Соскоб (мазок).

Забор материала производится универсальным зондом из уретры. При необходимости материал для исследования берется из генитальных язв (исследование на HSV-II, Haemophilus ducrei).

Рабочая часть зонда, содержащая исследуемый материал, отрезается или обламывается и помещается в одноразовую пробирку типа “Эппендорф” с консервирующим раствором.

Максимальный срок хранения материала 1 сутки в холодильнике при температуре +4°С – +8°С.

Сок предстательной железы:

После окончания массажа предстательной железы сок в количестве 0,5-1 мл собирают в одноразовую сухую пробирку типа “Эппендорф”. При невозможности получить сок, сразу после массажа собирают первую порцию мочи (в которой содержится сок предстательной железы) в количестве 10 мл (правила забора мочи смотрите выше).

Максимальный срок хранения 1 сутки в холодильнике при температуре +4°С – +8°С.

Забор и хранение биологического материала (кровь) для исследований методом ИФА (инфекции)

Забор крови производится натощак из локтевой вены одноразовой иглой (диаметр 0,8-1,1 мм) в одноразовый шприц объемом 5 мл или специальную вакуумную систему типа “Venoject” (с ЭДТА или без). При заборе в шприц кровь из него аккуратно (без образования пены) переносится в одноразовую “сухую” пробирку или в пробирку с антикоагулянтом (6% раствор ЭДТА в соотношении 1:19 или 3,8% раствор цитрата Na в соотношении 1:9).

Максимальный срок хранения сыворотки при температуре +4°С – +8°С – 48 часов

Максимальный срок хранения сыворотки при температуре -20°С – длительное хранение.

Забор и хранение биологического материала (кровь) для исследований на сифилис (Syphilis RPR, Syphilis TPHA, Syphilis TPHA (полуколичественный анализ), определения в сыворотке концетрации гормонов, онкомаркёров, аутоантител методом ИФА и для биохимических исследований

Забор крови производится:

Утром натощак (при динамическом наблюдении – всегда в одни и те же часы);

Только в “сухую” пробирку или специальную коммерческую вакуумную систему без антикоагулянта.

Забор крови производится натощак из локтевой вены одноразовой иглой (диаметр 0,8-1,1 мм) в сухую пробирку объемом 5 мл или специальную вакуумную систему типа “Venoject” (без антикоагулянта). Забор шприцом нежелателен в связи с опасностью возникновения гемолиза.

Кровь должна быть доставлена в лабораторию в день забора. Пробирку с кровью до исследования хранят в холодильнике при +4°С – +8°С.

Максимальный срок хранения сыворотки при температуре +4°С – +8°С – 48 часов.

Максимальный срок хранения сыворотки при температуре -20 °С – длительное хранение.

Допускается только однократная разморозка сыворотки.

Забор крови для определения субпопуляций и функциональной активности лимфоцитов и нейтрофилов

Забор крови производится:

Утром натощак (5 мл крови).

Для предотвращения свёртывания в кровь при взятии добавляют антикоагулянт: 20 единиц гепарина на 1 мл крови. Лучше использовать стандартные пробирки с гепарином (ВАКУТАЙНЕР на-гепарин или ли-гепарин на 5-7 мл с зелёными крышками фирмы Becton Dickinson).

Перед взятием крови равномерно распределить гепарин по стенкам пробирки.

При взятии шприцем, во избежании гемолиза, кровь в пробирку спускать плавно, без напора.

После взятия пробирку с образцом несколько раз перевернуть. Не встряхивать и не крутить на шейкере.

Кровь должна храниться не более 48 часов при комнатной температуре

При перевозке температура крови должна быть +18 °С – +24 °С

Для определения иммуноглобулинов и ЦИК в сыворотке крови,

забор крови производится только в сухую пробирку!!!

Условия забора и перевозки те же.

Забор и хранение биологического материала (кровь) для определения группы крови по системе AB0 и Резус-фактора

Забор крови производится натощак из локтевой вены одноразовой иглой (диаметр 0,8-1,1 мм) в одноразовый шприц объемом 5 мл или специальную вакуумную систему типа “Venoject” (с ЭДТА). При заборе в шприц кровь из него аккуратно (без образования пены) переносится в одноразовую пробирку с антикоагулянтом (6% раствор ЭДТА в соотношении 1:19 или 3,8% раствор цитрата Na в соотношении 1:9).

Кровь должна быть доставлена в лабораторию в день забора. Пробирку с кровью до исследования хранят в холодильнике при +4°С – +8°С.

Забор и хранение биологического материала (моча) для определения суточной экскреции 17-КС

Утренняя моча сбрасывается, следующие порции мочи, включая утреннюю порцию следующего дня, собираются в отдельную посуду. Объём собранной мочи перемешивается, измеряется(!). В баночку отливается 50 мл мочи.

Доставка образца с указанием диуреза – в те же сутки.

При более длительном хранении (более суток) требуется заморозка.

Забор исследуемого материала для бактериологических исследований

ОТДЕЛЯЕМОЕ УРОГЕНИТАЛЬНОГО ТРАКТА.

Правила подготовки больного к исследованию и забора материала:

Материал для исследования у женщин следует брать перед менструацией или через 1-2 дня после ее окончания. Рекомендуется воздержаться от мочеиспускания в течение 3-4 часов и половых сношений перед взятием материала.

Женщины в день явки на обследование не должны спринцеваться и проводить туалет наружных половых органов.

Исследуемый материал берут специальными одноразовыми зондами, ложкой Фолькмана, бактериологической петлей либо ушным зондом с затупленным концом.

За 5-7 дней до забора материала необходимо прекратить прием химиопрепаратов и лечебные процедуры.

Исследуемый материал должен быть без примесей крови.

При вялотекущих и хронических инфекциях урогенитального тракта рекомендуется применять один из следующих методов провокации:

биологическая: введение гоновакцины (500 млн. микробных тел) взрослым однократно, внутримышечно, детям старше 3-х лет- 100-200 млн. микробных тел. Детям до 3 лет не рекомендуется введение гоновакцины;

термическая: применение в течение 3-х дней диатермии с абдоминально-вагинально-сакральным расположением электродов по 30,40,50 мин или индуктотермии по 10,15,20 мин. Следует производить забор отделяемого из уретры, цервикального канала и прямой кишки через один час после каждого прогревания;

механическая: наложение металлического колпачка на шейку матки женщин на 4 часа, проведение массажа уретры мужчин на буже в течение 10 мин;

алиментарная: употребление соленой, острой пищи и алкоголя за 24 часа до исследования.

Не следует проводить химические провокации, так как они губительно действуют на некоторых возбудителей.

Забор материала производят после провокации и через 24-48-72 ч.

Взятие материала проводит врач акушер-гинеколог при подозрении на инфекционную природу патологического процесса.

Содержимое цервикального канала, полости и придатков матки в норме стерильно.

УРЕТРА

Перед взятием материала наружное отверстие уретры необходимо обработать тампоном, смоченным стерильным физиологическим раствором.

При наличии гнойных выделений соскоб надо брать либо сразу, либо через 15-20 мин после мочеиспускания, при отсутствии выделений следует провести массаж уретры с помощью зонда для взятия материала.

У женщин перед введением зонда в уретру необходимо провести ее массаж о лобковое сочленение.

В уретру женщин зонд ввести на глубину 1-1,5см, мужчин – на 3-4см и сделать несколько вращательных движений. У детей материал берут только с наружного отверстия уретры.

ВУЛЬВА, ПРЕДДВЕРИЕ ВЛАГАЛИЩА. Отделяемое берут стерильным ватным тампоном. При воспалении бартолиниевых желез производят их пункцию, при вскрытии абсцесса железы содержимое берут стерильным ватным тампоном.

ВЛАГАЛИЩЕ. Материал для исследования берут стерильным тампоном из заднего свода или с патологически измененных участков слизистой. Материал для посева должен быть взят до проведения мануального исследования.

ЦЕРВИКАЛЬНЫЙ КАНАЛ.

Перед взятием материала необходимо удаление ватным тампоном слизи и обработка шейки матки стерильным физиологическим раствором

Необходимо пользоваться кольпоскопом.

Зонд ввести в цервикальный канал на глубину 0,5-1,5 см.

При наличии эрозий цервикального канала необходимо их обработать стерильным физиологическим раствором, и материал следует брать с границы здоровой и измененной ткани.

При извлечении зонда необходимо полностью исключить его касание стенок влагалища.

Для посева может быть использован соскоб слизистой, полученный при диагностическом выскабливании стенок цервикального канала.

МАТКА Материал берется с помощью специальных инструментов типа шприца-аспиратора, имеющего на зонде покрытие.

ПРИДАТКИ МАТКИ

При воспалительном процессе в придатках матки материал из очага инфекции (гной, экссудат, кусочки органов) берется либо при оперативном вмешательстве, либо при проведении диагностической пункции в малом тазу, проводимой через влагалищные своды.

Взятый для исследования материал в транспортной среде может сохраняться до 24 часов при +4° С. Не допускается замораживание пробы.

МОЧА

Микробиологическое исследование мочи нужно проводить до начала антибактериальной терапии. Моча здорового человека стерильна.

Утром после тщательного туалета наружных половых органов в стерильную посуду собирают среднюю порцию свободно выпущенной мочи в количестве 3-5 мл. При подозрении на простатит получают 4 пробы: 3 порции мочи (первая и средняя порции при самопроизвольном мочеиспускании и последнюю через 5-10 минут после массажа предстательной железы) и секрет предстательной железы при массаже.

Взятие мочи с помощью катетера связано с риском инфицирования мочевыводящих путей, поэтому его желательно избегать. Катетеризацию производят в случаях, когда больной не способен мочиться или для разграничения воспалительного процесса в почках и мочевом пузыре. С этой целью мочевой пузырь опорожняют и вводят в него 50мл раствора, содержащего 40 мг неомицина и 20 мг полимиксина. Через 10 минут берут пробы мочи для исследования. При локализации процесса в мочевом пузыре моча остается стерильной. При инфицировании почек отмечается бактериурия.

Мочу больного можно получить путем надлобковой пункции мочевого пузыря. Этот метод взятия мочи дает наиболее достоверные результаты.

Микробиологическое исследование мочи надо проводить как можно быстрее после ее получения от больного, т.к. микробы, содержащие в моче, быстро размножаются при комнатной температуре, что может дать ложные результаты при определении степени бактериальной обсемененности. В связи с этим при исследовании мочи на степень бактериурии, от момента взятия пробы мочи до начала исследования в лаборатории должно проходить не более 1-2 часов.

При исследовании мочи на наличие возбудителей урогенитальных инфекций проба может сохраняться до 18 часов при +4° С.

При транспортировке проб мочи необходимо учитывать температуру внешней среды.

КИШЕЧНЫЙ ДИСБАКТЕРИОЗ

Материал (испражнение) на кишечный дисбактериоз забирается до начала лечения антибактериальными и химиотерапевтическими препаратами.

Кафедра клинической лабораторной диагностики с курсом ФПК и ПК

Перечень разделов по дисциплине клиническая лабораторная диагностика для подготовки к выполнению аудиторных контрольных работ в зимнюю лабораторно-экзаменационную сессию студентами 6 курса заочной формы обучения.

1. Организационная структура клинико-диагностической лаборатории.

2. Общеклинические лабораторные исследования.

3. Гематологические лабораторные исследования.

4. Лабораторные методы оценки гемостаза.

5. Биохимические лабораторные исследования.

6. Контроль качества лабораторных исследований.

Перечень контрольных вопросов по дисциплине клиническая лабораторная диагностика для подготовки к выполнению аудиторных контрольных работ в зимнюю лабораторно-экзаменационную сессию студентами 6 курса заочной формы обучения.

Структурная организация клинико-диагностической лаборатории.

Нормативные документы и приказы МЗ РБ, регламентирующие работу клинико-диагностической лаборатории.

Оборудование клинико-диагностической лаборатории.

Основная измерительная и аналитическая аппаратура клинико-диагностической лаборатории.

Основы техники безопасности и правила санэпидрежима при работе в клинико-диагностической лаборатории.

Правила взятия, доставки, приема, оформления и регистрации биологического материала.

Общеклинические лабораторные исследования.

Подготовка пациента к исследованию, сбор, хранение и обработка материала для общего анализа мочи.

Физические свойства мочи: цвет, прозрачность, запах, рН, относительная плотность мочи.

Химические свойства мочи, методы определения общего белка (качественный и количественный методы, методы «сухой химии»).

Определение глюкозы в моче при помощи индикаторной бумаги и глюкозооксидазным методом.

Правила приготовления нативного препарата мочевого осадка.

Количественное определение элементов организованного осадка мочи.

Определение элементов неорганизованного осадка.

Виды неорганизованных осадков.

Общий клинический анализ крови.

Характеристика методов определения СОЭ, концентрации гемоглобина, подсчета количества эритроцитов, цветового показателя, лейкоцитов и лейкоцитарной формулы.

Правила подготовки пациента, забор, хранение и обработка материала для общего клинического анализа крови.

Нормальные значения и пределы физиологических колебаний уровня эритроцитов и лейкоцитов периферической крови.

Правила приготовления препарата и подсчета в камере Горяева.

Метод определения гемоглобина крови гемоглобинцианидным методом.

Современное представление о костно-мозговом кроветворении.

Процентное содержание лейкоцитов в периферической крови. Диагностическое значение лейкоцитарной формулы.

Лабораторные исследования, характеризующие свертывающую систему крови.

Понятие о системе свертывания крови.

Первичный гемостаз. Лабораторные методы исследования первичного гемостаза.

Фазы коагуляционного гемостаза.

Фибринолиз.

Антикоагулянтная система.

Лабораторные методы оценки вторичного гемостаза.

Лабораторные исследования, характеризующие биохимические показатели крови.

Лабораторные показатели, характеризующие белковый обмен. Определение общего белка в сыворотке крови биуретовым методом.

Остаточный азот и его компоненты. Методы определения мочевины, креатинина, мочевой кислоты.

Методы исследования ферментов. Клинико-диагностическое значение определения активности ферментов.

Биологическая роль углеводов. Определение содержания глюкозы ферментативным методом.

Липопротеины плазмы крови. Лабораторные показатели липидного обмена.

Образование и метаболизм желчных пигментов. Клинико-диагностическое значение исследования показателей пигментного обмена.

Аналитическая надежность и контроль качества клинических лабораторных исследований.

Аналитическая оценка лабораторных результатов. Виды ошибок, их характеристика.

Внутрилабораторный контроль качества. Методы контроля воспроизводимости результатов исследования. Контроль правильности результатов исследования.

C оставление аналитического лабораторного заключения.

Аналитическое лабораторное заключение составляется по условиям ситуационной задачи.

На основании их анализа предложенных лабораторных данных необходимо ответить на следующие вопросы:

Принцип, лежащий в основе анализируемого метода;

Необходимое оборудование;

Правила подготовки исследуемого материала и основные источники ошибок возможных при выполнении данного метода;

Единицы измерения;

Понятие о референтных значениях. Клинико-диагностическое значение анализируемого метода.

Практические навыки:

Организация рабочего места для выполнения лабораторных исследований;

Приготовление реагентов в необходимой концентрации;

Прием, маркировка и хранение биологического материала;

Выполнение общего анализа крови;

Выполнение общего анализа мочи;

Выполнение гемостазиологического исследования;

Выполнение биохимических исследований;

Оформение результатов лабораторных исследований;